作者hicage (hicage)
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標題預測RE切點與實際結果不符合
時間Tue Apr 28 14:07:48 2009
想要請教板上大大,
不知道各位有沒有這樣的經驗,
小妹我用<BstAPI>切targeting vector,
依照NEB預測切點軟體, 理論上應該會看見 2+13 kb的兩個band,
但是結果總是跑出異常的pattern,
與未切的targeting vector比較, BstAPI的確有作用, 因為pattern與vector不同,
但是卻不是預測的 2+13 kb的兩個band,
digestion condition完全依這NEB的建議,
Buffer4,
10xBSA,
incubate @ 60度
total DNA ~0.5ug
我試過digestion 1, 2,或 3 hrs,
pattern略有不同, 但是都不正確,
爬文有發現某些enzyme site有甲基化的問題,
但是我的結果似乎不像是enzyme 切不動,
希望有類似經驗的大大可以分享一下經驗!!謝謝!!
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 75.72.179.213
1F：推 ray289:有圖嗎...? 04/28 15:02
2F：推 ranilla:來張圖會比較清楚一點 04/28 15:02
3F：→ ranilla:建議0.2ug in 20ul total volume，不用BSA，0.5ul enzyme 04/28 15:04
4F：→ ranilla:大於1/20的enzyme，裡面所含的glycerol會影響反應 04/28 15:05
5F：→ hicage:謝謝大家的建議, 我會試著把圖補上 04/28 15:07
6F：推 ranilla:另外，用別的酵素試試看看是vector還是BstAPI的問題 04/28 15:10
7F：→ hicage:vector定序過了,理論上沒有問題,(當然小機率可能出錯) 04/28 15:15
8F：→ hicage:因為定序沒有辦法讀到BstAPI site 04/28 15:16
9F：→ hicage:我用過AscI確認,band的size是正確的 04/28 15:17