作者withheart (GOOD)
看板Biotech
標題[求救] 關於抽DNA的步驟
時間Sat Feb 7 04:36:54 2009
所抽的DNA是要跑 DNA ladder的
實驗室方法大致如下：
1.收細胞完之後
2.泡製最終lysis buffer (DNA lysis buffer + proteinase K)
(proteinase K stock 為 20mg/ml，加的量為 DNA lysis buffer的1/20)
3.加入最終lysis buffer，多寡視細胞數而定。
4.將細胞攪散到完全透明狀。
(使用tip攪散，不可以pipet也不可以votex，否則DNA會斷掉)
5.用parafilm封口加熱，56 ℃，10~14hr。
6.加熱完後，加入RNase A 3-5λ(10mg/ml)，56℃ 1小時
7.加入和最終lysis buffer等量的phenol
(我們實驗室使用 PHENOL: CHLOROFORM: ISOAMYL ALCOHOL*25:24:1)
上下混合均勻5分鐘
8.離心，4℃ 12000rpm 5分鐘，剪10 ml tip抽出分層中的上層物質
9.抽完之後,加入與剛剛上層物質等量的chloroform, 上下混合均勻5分鐘
10.離心，4℃ 12000rpm 5分鐘，抽出上清液 (最少10λ---DNA在裡面)
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上面是抽DNA的步驟
接下來就是跑膠了!!
只是做了兩次～DNA似乎都沒有抽好！！
(因為跑出來沒有band ><)
請問板上大大
有什麼地方是我需要更加注意的嗎？？
謝謝大家!!
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※ 編輯: withheart 來自: 220.229.173.66 (02/07 11:18)
1F：推 kemp6611:step 5(溫度太高,反應時間也太長了吧!)買kit來抽DNA最快! 02/08 01:02
2F：推 xman0324:在過phenol時搖太用力dna也會斷 06/05 13:17