※ 引述《HIbaby (燃燒吧! 嗨~北鼻!)》之銘言： : 標題: Re: [問題] promoter 分析問題 : 時間: Sun Sep 28 19:23:51 2008 : : ※ [本文轉錄自 PhD 看板] : : 作者: alexflybaal (Evanescance) 站內: PhD : 標題: Re: [問題] promoter 分析問題 : 時間: Sun Sep 28 02:10:13 2008 : : ※ 引述《flywind1209 (飛翔風~)》之銘言： : : 想請教做 gene regulation 的專家,在分析promoter時,除了要考慮到sense DNA : : 也要考慮antisense strand DNA sequence 嗎? (假設X gene位於 sense strand DNA) : : 接著問,假設調控X基因的 transcription factor有6個,會發生下列情形嗎 : : 其中4個在 sense 剩下2個在 anti-sense,也就是分布在不同的strand DNA上... : : 因為沒遇過,也不曉的實際情形是怎樣,請專業的朋友來解答囉,感激不盡! : : 我分享一下我的經驗 : : 當你clone到你的promoter後 : : 你應該會用GCG或是像TESS的網站收尋你的調控位置 : : 也有可能藉由其他的paper所提供transcription factor binding site的序列 : : 利用一些像DNA star或是VectroNTI或是workbench等 : : 畫出可能的transciption factor binding site的分佈 : : 這個部份一定會出現sense以及antisense的分佈 : : 不過這是正常的 : : 你應該要搞清楚的是 你現在是進行的cis regulation的研究 : : 實際上妳要驗證promoter上哪個部分是調控的部份 : : 可以進行幾個實驗 : : footprinting -- 可以找出promoter上哪些部份會與transcription factor : 結合, 做出分佈, 這個實驗不好作, 有時候結果不好看出 : : Dual leuciferase assay -- 這個是promega的kit, 不過還蠻昂貴的, 需要 : 冷光儀, vector自己買, transfection reagent : 自己買, 還要避免用到不適合的cell line : : 上面二選一即可 : : EMSA -- 當你找到某個promoter區域可能跟某些transcription factor結合 : 妳可以利用這個實驗, 驗證某個transcription factor會與你所找到 : 的區域結合 : : 再來就是一些transcription factor活化, 基因表現的實驗 : : 介紹一本不錯的書 : : Methods in molecular biology v.130 : Transcription factor protocols / edited by Martin J. Tymms. : : 裡面應該會有你所有會進行promoter研究的實驗方法和概念 : : 那麼就預祝實驗順利囉 ------------------------------------ 以上A大說法有幾個盲點存在: 1.除了cis-regulation 外,trans-regulation也挺常見的呢! 2.footprinting和EMSA都屬於探討promoter序列是否有transcription factor binding 這兩種方法才是二選一吧？不然本錢夠雄厚的話,拿去用MS打一打也可以知道啦~ 3.luciferase activity assay 只是ㄧ種測試promoter是否具有活性的方法， 並無法證實factors會與序列binding, 　luciferase 也只當作reporter gene得一種選擇罷了， reporter gene百百種，B-galactoside, CAT, 或是其他也很常用， 　為什麼要選一個連帶硬體設備都要一起買的kit呢? 陽春單管luciferase偵測儀要近20萬,多管的動輒上百萬, 你們實驗室很有錢嗎? 另外,A大介紹的書還真的不錯,可惜對於日新月異的技術發展而言,2000出版的內容稍嫌舊了點, 原理沒有問題,不過真要運用做分析,有很多方法都要再改良吧. 以上,小建言. : : -- :

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) : ◆ From: 118.160.137.199 : 推 flywind1209:謝謝A大詳細的解說 所以兩股都要考慮進去囉^^ 09/28 02:12 : → flywind1209:還少了一個很重要的實驗喔>> ChIP 09/28 02:12 : 推 HIbaby:幫轉 biotech 09/28 19:23 : : -- :

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) : ◆ From: 133.11.198.91 : 推 hajimels:推一個~ 09/29 13:16 : → hajimels:推原作者及轉過來的HIbaby 09/29 13:17 --

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