※ 引述《sGoat (無三小羚羊)》之銘言： : ※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之銘言： : : 3.5kb說大不大、說小也不小… : : 這個gene在我手上就是clone不出來…Orz : : 提到primer專一性不夠的原因，我的primer設計出來有33-35mer : : (含有酵素切位)，我也blast primer在NCBI上，確時是會有blast : : 到genomic DNA，但是我的total RNA已經用DNase I處理過，PCR : : 出來還是有很band…而且在1kb的位置特別亮… : : 想問的問題是要怎麼提高我的primer專一性，長度夠、GC%也正常 : : 在47和50%、Tm為72和76…還有那個地方要注意的嗎？ : 先無差別clone起來再去做Rapid Screen,挑出你要的3.5K的clone來做... : 請問是用Taq去P還是用Pfu? 我是用Advantage 2 Polymerase號稱可以PCR出13kb！ 用Pfu P完直接ligation是接不起來的歐... 因為PCR product沒有多一個A…對了為啥會多一個A啊？ : : 另外，我的第二個問題，為什麼會這麼問，是因為牽涉到primer設 : : 計上考量，假如是先接好我要的gene，這樣子primer酵素切位的設 : : 計上，就簡單多了，問題是non-circular的片段可以用ligase接起 : : 來嗎？ : 1.將你步驟一PCR出來的3.5K片段clone進T-A cloning vector... : 挑出來之後純化 > 用你設計的酵素double digestion > 酒精沉澱,回溶 : 2.將你的vector以你要的酵素做double digestion > 酒精沉澱,回溶 : 3.算好molar ratio後將1.2.加在一起ligation : 便宜簡單又不用check正反接 是的，其它的gene我也是用這種方法接上去的… 非常的簡單，但是TA vector有點貴…Orz 為什麼想分段cloning，主要原因是我的PCR有很多band，雖然直接 把3.5kb的gel切下來做cloning，但是定序完之後並不是我想要的 gene…Orz : : 假如先接上某一片段，primer酵素切位的設計上就很傷腦筋了… : : 由於我用的vector是自己做的，切位由5'開始，只有NheI、PacI : : 、PmeI和NsiI可以用… : : 舉列來說： : : NheI---1.7kb---NsiI : : NisI---1.8kb---NsiI : : 先接上1.7kb到vector，之後再接上1.8kb…不過還要再check是正 : : 接還是反接…Orz : : 我想到的分段接的primer酵素切位只有這個，還有其它的方法嗎？ : : 話說回來，有個gene約1.5kb，primer Tm為72和82，我用52℃就 : : 可以得到single band…哎…cloning真是很神奇的實驗…Orz : 因為你Tm要是設太高primer跟template已經是若即若離了 : 太嚴苛的條件是P不出來的... : 太長時間擴增,長時間高溫也是不好... 其實我都P的出來，主要是gel上非專一性的band很多… 太長時間擴增…一般我都跑到30個cycl… 感謝大家的回答 --

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