※ 引述《sGoat (无三小羚羊)》之铭言： : ※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之铭言： : : 3.5kb说大不大、说小也不小… : : 这个gene在我手上就是clone不出来…Orz : : 提到primer专一性不够的原因，我的primer设计出来有33-35mer : : (含有酵素切位)，我也blast primer在NCBI上，确时是会有blast : : 到genomic DNA，但是我的total RNA已经用DNase I处理过，PCR : : 出来还是有很band…而且在1kb的位置特别亮… : : 想问的问题是要怎麽提高我的primer专一性，长度够、GC%也正常 : : 在47和50%、Tm为72和76…还有那个地方要注意的吗？ : 先无差别clone起来再去做Rapid Screen,挑出你要的3.5K的clone来做... : 请问是用Taq去P还是用Pfu? 我是用Advantage 2 Polymerase号称可以PCR出13kb！ 用Pfu P完直接ligation是接不起来的欧... 因为PCR product没有多一个A…对了为啥会多一个A啊？ : : 另外，我的第二个问题，为什麽会这麽问，是因为牵涉到primer设 : : 计上考量，假如是先接好我要的gene，这样子primer酵素切位的设 : : 计上，就简单多了，问题是non-circular的片段可以用ligase接起 : : 来吗？ : 1.将你步骤一PCR出来的3.5K片段clone进T-A cloning vector... : 挑出来之後纯化 > 用你设计的酵素double digestion > 酒精沉淀,回溶 : 2.将你的vector以你要的酵素做double digestion > 酒精沉淀,回溶 : 3.算好molar ratio後将1.2.加在一起ligation : 便宜简单又不用check正反接 是的，其它的gene我也是用这种方法接上去的… 非常的简单，但是TA vector有点贵…Orz 为什麽想分段cloning，主要原因是我的PCR有很多band，虽然直接 把3.5kb的gel切下来做cloning，但是定序完之後并不是我想要的 gene…Orz : : 假如先接上某一片段，primer酵素切位的设计上就很伤脑筋了… : : 由於我用的vector是自己做的，切位由5'开始，只有NheI、PacI : : 、PmeI和NsiI可以用… : : 举列来说： : : NheI---1.7kb---NsiI : : NisI---1.8kb---NsiI : : 先接上1.7kb到vector，之後再接上1.8kb…不过还要再check是正 : : 接还是反接…Orz : : 我想到的分段接的primer酵素切位只有这个，还有其它的方法吗？ : : 话说回来，有个gene约1.5kb，primer Tm为72和82，我用52℃就 : : 可以得到single band…哎…cloning真是很神奇的实验…Orz : 因为你Tm要是设太高primer跟template已经是若即若离了 : 太严苛的条件是P不出来的... : 太长时间扩增,长时间高温也是不好... 其实我都P的出来，主要是gel上非专一性的band很多… 太长时间扩增…一般我都跑到30个cycl… 感谢大家的回答 --

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