※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之銘言： : 3.5kb說大不大、說小也不小… : 這個gene在我手上就是clone不出來…Orz : 提到primer專一性不夠的原因，我的primer設計出來有33-35mer : (含有酵素切位)，我也blast primer在NCBI上，確時是會有blast : 到genomic DNA，但是我的total RNA已經用DNase I處理過，PCR : 出來還是有很band…而且在1kb的位置特別亮… : 想問的問題是要怎麼提高我的primer專一性，長度夠、GC%也正常 : 在47和50%、Tm為72和76…還有那個地方要注意的嗎？ 先無差別clone起來再去做Rapid Screen,挑出你要的3.5K的clone來做... 請問是用Taq去P還是用Pfu? 用Pfu P完直接ligation是接不起來的歐... : 另外，我的第二個問題，為什麼會這麼問，是因為牽涉到primer設 : 計上考量，假如是先接好我要的gene，這樣子primer酵素切位的設 : 計上，就簡單多了，問題是non-circular的片段可以用ligase接起 : 來嗎？ 1.將你步驟一PCR出來的3.5K片段clone進T-A cloning vector... 挑出來之後純化 > 用你設計的酵素double digestion > 酒精沉澱,回溶 2.將你的vector以你要的酵素做double digestion > 酒精沉澱,回溶 3.算好molar ratio後將1.2.加在一起ligation 便宜簡單又不用check正反接 : 假如先接上某一片段，primer酵素切位的設計上就很傷腦筋了… : 由於我用的vector是自己做的，切位由5'開始，只有NheI、PacI : 、PmeI和NsiI可以用… : 舉列來說： : NheI---1.7kb---NsiI : NisI---1.8kb---NsiI : 先接上1.7kb到vector，之後再接上1.8kb…不過還要再check是正 : 接還是反接…Orz : 我想到的分段接的primer酵素切位只有這個，還有其它的方法嗎？ : 話說回來，有個gene約1.5kb，primer Tm為72和82，我用52℃就 : 可以得到single band…哎…cloning真是很神奇的實驗…Orz 因為你Tm要是設太高primer跟template已經是若即若離了 太嚴苛的條件是P不出來的... 太長時間擴增,長時間高溫也是不好... --

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