※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之銘言： : 最近在clone一些轉錄因子大小約1-3kb左右 : 先簡述一下我如何clone…Orz : 1.先確定這些基在老鼠身上，何時、何處會表現？ : 2.利用invitrogen Trizol萃取RNA : 3.利用Bio-Rad iScript-cDNA-Synthesis合成cDNA : 4.設計primer(長度約30左右，因有加RE site) : QA：不知道是我設計的primer專一性不夠高或是其它 : 原因，PCR完之後跑膠會有很多band？已試過 : gradient temp，還是有很多band…Orz，所以我 3'以及5'UTR所以長度有很多種 : 　　直接切下我要的大小片段的gel，之後subclone : 　　到Topo vector上，在colony PCR及enzyme digestion : 中，其片段大小都是正確的… : QB：我成功ligation幾個gene到vector上，定序之後 : 發現只有primer序列是對的，而中間序列完全是 : 錯的，與老闆討論之後，有可能是genomic DNA : 污染了？ 先看看是不是primer設計不良 : QC：回頭看看合成cDNA用的kit，說明書上寫最佳合成 : 片段約1kb，但是有我clone出正確的gene約1.5kb : ，是這個原因造成我有些gene，clone出來是錯誤 : 的序列嗎？ 1-3K是正常情形,若長度更長要分兩次加RT酵素效益才比較好 protocal上那樣說是因為它預設RT時間為一小時左右 : QD：有人知道reverse transcriptase的合成速率嗎？ 你看它建議時間與最佳片段就可大約推算出來 但是一般來說還是不會比Taq快... : 一般的incubation時間只要一小時左右，這樣要 : clone大片段gene會clone的出來嗎？可以推薦 : clone專用的reverse transcriptase嗎？ 其實MMLV RT都大同小異差的是kit裡面附的primer 所以回頭看一下你的primer比較重要 : 　　　　　　　　　　　　　以上感謝各位回答…謝謝 --

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