※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之铭言： : 最近在clone一些转录因子大小约1-3kb左右 : 先简述一下我如何clone…Orz : 1.先确定这些基在老鼠身上，何时、何处会表现？ : 2.利用invitrogen Trizol萃取RNA : 3.利用Bio-Rad iScript-cDNA-Synthesis合成cDNA : 4.设计primer(长度约30左右，因有加RE site) : QA：不知道是我设计的primer专一性不够高或是其它 : 原因，PCR完之後跑胶会有很多band？已试过 : gradient temp，还是有很多band…Orz，所以我 3'以及5'UTR所以长度有很多种 : 　　直接切下我要的大小片段的gel，之後subclone : 　　到Topo vector上，在colony PCR及enzyme digestion : 中，其片段大小都是正确的… : QB：我成功ligation几个gene到vector上，定序之後 : 发现只有primer序列是对的，而中间序列完全是 : 错的，与老板讨论之後，有可能是genomic DNA : 污染了？ 先看看是不是primer设计不良 : QC：回头看看合成cDNA用的kit，说明书上写最佳合成 : 片段约1kb，但是有我clone出正确的gene约1.5kb : ，是这个原因造成我有些gene，clone出来是错误 : 的序列吗？ 1-3K是正常情形,若长度更长要分两次加RT酵素效益才比较好 protocal上那样说是因为它预设RT时间为一小时左右 : QD：有人知道reverse transcriptase的合成速率吗？ 你看它建议时间与最佳片段就可大约推算出来 但是一般来说还是不会比Taq快... : 一般的incubation时间只要一小时左右，这样要 : clone大片段gene会clone的出来吗？可以推荐 : clone专用的reverse transcriptase吗？ 其实MMLV RT都大同小异差的是kit里面附的primer 所以回头看一下你的primer比较重要 : 　　　　　　　　　　　　　以上感谢各位回答…谢谢 --

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