作者MrCAKE (Keep Working)
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標題Re: [求救] DNA總是切不好
時間Fri May 2 12:14:12 2008
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
: ◆ From: 210.209.240.239
: 推 nixo:DNA純化的乾淨嗎？ 05/02 00:12
: 推 HEYHEYHEY:20ng很少耶 05/02 00:36
: 推 dankai:DNA品質很重要~~不然切不動!!你做的濃度也太太太低了~ 05/02 00:54
: 推 MacBook:看你enzyme加得量 我猜你是想講20microgram吧 05/02 01:35
: → MacBook:最後wash完再放到便當盒裡用0.1xSSC 喇喇～ 05/02 01:36
: → MacBook:為什麼要三小時候再補加? 05/02 01:38
: 推 enisx:他補加的目的應該就是怕酵素不夠力所以多加些 05/02 07:33
: → enisx:用較high stringency的條件,同樓上說用低%的SSC與再高一點的 05/02 07:35
: → enisx:溫度 我都用62度 05/02 07:37
: → enisx:EcoRI和BamHI 37度切個3hr就夠啦不用切o/n(切不好可能你的 05/02 07:39
: → enisx:enzyme或是reacction buffer有點問題 05/02 07:40
: → beautyfish:我的DNA裡面的RNA的確較多 所以切酵素的時候我有添加 05/02 10:29
: → beautyfish:RNase一起下去切 另外我用的濃度是micro gram 05/02 10:29
: → beautyfish:昨天的確打錯了 = =|| 05/02 10:30
: → beautyfish:而enzyme跟reaction buffer都是新買的耶>"< 05/02 10:30
你的DNA純度可能有問題
像是protein、polysaccharides、RNA等抽DNA時殘存的汙染
都可能影響限制脢的作用
我建議可以再純化一下你的DNA
或是限制脢作用時把總體積放大來切
像是把20ul的總體積放大成200ul(限制脢的量不用改變)
應該就可以有效的改善切不好的現象
之後再濃縮體積loading就可以了
Good luck!!!
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◆ From: 140.112.60.16
1F：推 yaliu:20ug很濃耶...這樣total 3ul切,真的切的完嗎? 基本上我用 05/02 13:12
2F：→ yaliu:NEB的EcoRI 效率跟他產品寫的差很多 新品也一樣= =||| 05/02 13:14
3F：→ MrCAKE:這很難說 不過如果DNA品質有問題的話 05/02 13:21
4F：→ MrCAKE:多加酵素無法有效解決問題 05/02 13:21
5F：→ MrCAKE:3ul一般來說是30U 如果切不完當然可以補 05/02 13:23
6F：→ MrCAKE:反正EcoR1和BamH1都不貴 不過我還是覺得問題出在DNA 05/02 13:24