作者beautyfish (天使光)
看板Biotech
標題[求救] DNA總是切不好
時間Thu May 1 23:14:47 2008
我目前在做 Southern Blot 已經卡很久了
跟實驗室其他人用一樣的產品跟Buffer但很常沒成功
通常都是背景值過深 所以無法看出對比
但是我洗片的流程都有按照protocol再延長一倍的時間
前陣子好不容易做出來
但最近要做repeat data又發現DNA切不好
我用的酵素是EcoR1與BamH1分別對我的DNA做裁切
用的DNA濃度是20ng
之前用這樣的量切Kpn1+Bgl2都切的很好
但切單一酵素時大多數的DNA跑電泳後都累積在上面沒有切開
就算我減少DNA的量還是一樣= ="
我的切法是取20ng的DNA先用1.5 micro liter的酵素切3小時
3小時後再補1.5 micro liter 的酵素切 O/N
請問有什麼方法可以讓我的DNA切的比較好?
另外有減少Southern背景值的方法嗎?
我用的hybridazation temp.是60度C
非常的感謝版上大大的幫忙
謝謝
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在大海中泅泳的魚
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還是心甘情願的待在你的 水藍色天堂
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◆ From: 210.209.240.239
1F：推 nixo:DNA純化的乾淨嗎？ 05/02 00:12
2F：推 HEYHEYHEY:20ng很少耶 05/02 00:36
3F：推 dankai:DNA品質很重要~~不然切不動!!你做的濃度也太太太低了~ 05/02 00:54
4F：推 MacBook:看你enzyme加得量 我猜你是想講20microgram吧 05/02 01:35
5F：→ MacBook:最後wash完再放到便當盒裡用0.1xSSC 喇喇～ 05/02 01:36
6F：→ MacBook:為什麼要三小時候再補加? 05/02 01:38
7F：推 enisx:他補加的目的應該就是怕酵素不夠力所以多加些 05/02 07:33
8F：→ enisx:用較high stringency的條件,同樓上說用低%的SSC與再高一點的 05/02 07:35
9F：→ enisx:溫度 我都用62度 05/02 07:37
10F：→ enisx:EcoRI和BamHI 37度切個3hr就夠啦不用切o/n(切不好可能你的 05/02 07:39
11F：→ enisx:enzyme或是reacction buffer有點問題 05/02 07:40
12F：→ beautyfish:我的DNA裡面的RNA的確較多 所以切酵素的時候我有添加 05/02 10:29
13F：→ beautyfish:RNase一起下去切 另外我用的濃度是micro gram 05/02 10:29
14F：→ beautyfish:昨天的確打錯了 = =|| 05/02 10:30
15F：→ beautyfish:而enzyme跟reaction buffer都是新買的耶>"< 05/02 10:30
16F：推 blence:BamHI請盡量不要切o/n,你只要E跟B都各加2ul直接切2h就夠了 05/02 12:40
17F：推 enisx:RNase理論上不會影響digest 05/02 12:53
18F：推 alaric:先確定是哪一個enzyme切不動? buffer是否需要加BSA? 05/03 03:12
19F：→ beautyfish:謝謝大家的熱情回答 後來已經有切好了 謝謝^^ 05/03 15:42
20F：推 enisx:可否把你動了什麼條件,使得實驗得以成功跟大家分享一下!:D 05/03 21:51