※ 引述《tzengchichau (無)》之銘言： : ※ 引述《[email protected] (星空下的神話)》之銘言： : : 想請問一下各位先進 : : 在純化蛋白質中，我要純化his-tag的融合protein，使用的是Ni-NTA來純化， : : 想請教的部分就是： : : 1.為什麼buffer的ph值是保持在7.9呢? : PH值也會影響his_tag PROTEIN binding 但PH值只要7.4_到8都可以啊 : 不一定要在7.9。 : : 2.binging buffer中有的會加入imidazole,這個物質不是只和histidine競爭Ni，為什麼 : : 會用在binding buffer裡呢?(其實也想問一下binding buffer的功能是什麼) : 低濃度的IMIDizole是用來洗去column非專一性的結合蛋白。 : 也可以再加入高濃度的NACL這樣最後收集的蛋白會比較純 : : 3.elution buffer中有imidazole我能理解，可是washing buffer中為什麼也有呢? : : 實驗室使用的imidazole濃度分別為： : : 8X binging buffer：40mM imidazole 我猜你要打的是binding buffer : : 8X washing buffer：480mM imidazole : : 4X elute buffer：4M imidazole : : 求救一下了>"< binding buffer有imidazole是為了減少非專一性蛋白 washing buffer當然也要用imidazole 理由也一樣 為了增加純度 會跟ni-nta接合只要有imidazole group就能接合...很難避免只能減少 所以很多非你目標的protein也能去搶這些接合位 在wash的時候當然要用一些去把他洗掉..當然同時也會犧牲一些你的目標protein -- 上帝曾經說過 : 當一個人打你右臉的時候 你就要用日耳曼背橋摔壞它的左臉 --

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