以個人最近操作相關實驗所遇到的問題 整理一下可能需要小心的部分 1.通常給RealTime PCR 使用的RNA sample會做DNase treatment的原因 多是為了避免genome DNA干擾..如果你的cDNA片段在genome DNA也有一模一樣的 利用SYBR green 或是TaqMen都會被測出來 這樣的讀值，就非單純因為RNA轉錄出來的cDNA所造成的 所以通常會有以下兩種方式排除genome DNA的干擾 A.RNA sample 利用DNase treatment.... B.primer design 跨過junction..... 也就是跨過一個intron..這樣也可以避免genome DNA的污染 EX:如下圖 == 代表 exon -- 代表 intron __ 代表 primer 5'__ ========-----------------======== exon intron __ 3' 補充說明原理：RealtimePCR的產物通常都很短... 而genome DNA上的intron如果被PCR出來，常是好幾K或數百bp 以RealtimePCR常用的短時間anealing time 來說，不太PCR的出來 另 在Dissociation Curve中也會看到不同溫度的產物.... 2.另外一種DNA污染，plasmid ..... 如果要測定的A基因已在同一個實驗室中重複反覆的一直操作 只要primer設計時在ORF中......無論有無intron的設計 primer都會在含有A基因的plasmid中PCR出相同的產物 如果在抽RNA的操作上稍有不慎....很有可能發生類似的狀況.... 或是 Realtime PCR 操作中時，都有可能發生 解決方式.. A:使用有filter的tipe操作RNA純化和Realtime PCR B:RNA純化之後，利用DNase treatment...再進行RT轉錄 C:在Laminar Flow中操作Realtime PCR 避免plasmid 污染 D:在有plasmid 污染的狀況下，水或所有試劑 都要特別小心處理 3.RNA抽完之後，我通常會跑一片RNA gel確認一下RNA的品質 因為RNA 如果已經degrade了..跑膠是最容易看出品質的方式 OD值有時反而沒這樣的直覺性.... 4.通常RNA取一定的量之後做RT...... Sample就以RNA當初所取的量為主，再取相同體積的cDNA來做實驗... 另 有時會有人為了確定RT 與 NoRT 的差異比較 而取相同量的RNA與已經RT過的cDNA做相對比較，來證明RT是在此次實驗中是成功的 Deta所呈現的數值是可信的.............. 5.最後 你提到RT前為何要先在65度反應 主因是 RNA常有二級結構的問題 利用65將結構打開，以利之後RT的反應完整.... ※ 引述《crazyrange (熱血羽球)》之銘言： : 我在萃取RNA之後 沒有用DNase : 結果我在測量RNA量的時候 我也同時去測量DNA的量 : 的確也偵測到了DNA的量 而且還不低 : 我想請問一下 : 在我抽取的RNA中還有DNA的話 : 對於我接下來要做的RT會有很大的影響嗎? : 我是這樣想的 : RNA是單股 DNA是雙股 : 可是在跑RT的時候 加入的過程中DNA會分解成單股 : 而加入的primer是random primer : 這樣的話在做RT的時候 DNA是不是也會被反轉錄? : 那如果在萃取完RNA後加入DNase去反應 : 是否之後在測量RNA濃度的時候就會測不到DNA的存在? : 在RT之後的cDNA需要測cDNA濃度嗎? : 還是說因為在跑RT之前的RNA就已經是固定量(ug) : 所以RT出來的cDNA可以不用測 不同sample可以直接用同量(ul)的template : 去跑real-time PCR? : 整個疑惑 -- 夜生活不只是一種生活，更是一種態度，音樂有很多類型，夜店有很多種類 喜歡與否只是一種偏好，卻不代表全部的選擇，夜生活的多樣與多變應該是 讓人有更多更廣的眼光看生活與體驗......... --

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