作者crazyrange (熱血羽球)
看板Biotech
標題Re: [求救] 關於real-time PCR的問題
時間Thu Apr 24 19:13:04 2008
我跑完RT之後
我試圖測量裡面的DNA濃度
我的作法是同樣sample分別加入A:1ug及B:2ug RNA template進行RT
結果出來之後我分別去測量裡面的DNA及RNA濃度
得到的結果為
DNA濃度 A260/280 RNA濃度 A260/280
A 1.9732ug/ul 1.83 1.5475ug/ul 1.87
B 2.0285ug/ul 1.83 1.6260ug/ul 1.89
讓我覺得疑惑的是
1.為什麼還測得到RNA,是因為原本的template嗎?可是我只加入1or2ug補到20ul中,
怎麼測出來的濃度這麼高.而RNA的濃度也沒有成兩倍比例,是因為pipette error?
2.測出來的DNA沒有呈現兩倍的差異,是因為其中含有dsDAN及cDNA嗎?
所以只有cDNA是變成兩倍而dsDNA沒有,所以才會造成total DNA不會呈現兩倍差?
3.如果有一組C他與B的條件相同只是不同sample,那麼同樣加入2ug進行RT之後,
出來的cDNA量是否是跟B一樣,因為一開始用同樣量的RNA?
4.還是說因為抽出來的RNA包含tRNA.mRNA.rRNA,而RT只有將mRNA轉成cDNA?
還是全部的RNA都會被轉成cDNA?
RT的條件是(kit的條件)
25度C 10分鐘
37度C 120分鐘
85度C 5秒鐘
我看paper上說做RT前會將RNA與primer混合,
然後在65度C反應10分鐘再放到冰上
接著在加入其他材料
然後才依照溫度與時間做RT反應(42度C 50分鐘;70度C 15分物鐘)
5.我的第 一個溫度是25度C的室溫
請問這會有麼差異嗎?
謝謝各位 幫我解決我的困惑
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◆ From: 59.120.7.114
1F：推 piggylo:你是不是用ABI的kit轉RNA的？我們家也是用這個，應該是沒 04/24 20:47
2F：→ piggylo:問題。而你提到另外一個不同的溫度設定應該是因為不同家的 04/24 20:48
3F：→ piggylo:RT，所以才有不同的作法。 04/24 20:49
4F：→ piggylo:至於轉成cDNA後需不需要測濃度，我之前有問過廠商，她們是 04/24 20:50
5F：→ piggylo:度測定，所以她們是建議就把cDNA的濃度視為跟當初反應的 04/24 20:51
6F：→ piggylo:RNA濃度相同就好了。 04/24 20:53
7F：推 piggylo:sorry,有字不見了，所以再補充一下 04/24 20:54
8F：→ piggylo:廠商是說RT所加的dNTP會干擾後來的濃度測定，所以轉成cDNA 04/24 20:55
9F：→ piggylo:後不需要測濃度。 04/24 20:56
10F：推 amide:NanoDrop測RNA/DNA只是單純測260吧 只有乘回去的factor不一 04/24 23:42
11F：→ amide:樣吧 沒有辦法分出RNA或是DNA? 04/24 23:42
12F：→ crazyrange:謝謝P大的解說 我們家是用ABI的KIT沒錯 04/25 09:27
13F：→ crazyrange:請問A大,那看濃度的時後,要直接以他上面顯示的濃度 04/25 09:31
14F：→ crazyrange:為準,還是以A260去乘以factor來換算濃度好？ 04/25 09:31
15F：→ crazyrange:更正.我後來發上面兩者是一樣的 04/25 11:35