作者Nox4156 (人真好!)
看板Biotech
標題[求救]請問一下純化inclusion body的方法@@
時間Wed Apr 23 18:41:02 2008
請問一下各位@@! 我在純化inclusion body時 (我的protein帶有His-tag)
破完菌，離心完後取沉澱物 以含有1% Triton X-100之buffer洗完五次後
再用不含1% Triton X-100洗完最後一次後 離心取沉澱加入含有6M Gu.HCl之buffer
然後放在室溫下旋轉到明天
隔天後，離心取上清加入Ni-NTA agarose 旋轉隔夜後
以含有6M Gu.HCl之buffer (含有10mM, 100mM, 500mM imidazole)流洗之
後來取5ul以bradford assay都測不到蛋白質 但是flowthrough的部分卻很藍!
(但是我發現流洗的時候Resin的顏色變成了白色的了!@@)
我猜測是不是Resin內的Ni已經被流洗掉而失去功能了~
還是說這一個Resin無法耐到這麼高的濃度?
如果我改用HisTrap FF的管柱不知道行不行的通~
(我有去查Manual，裡頭說可以耐到4~6M的Gu.HCl)
如果改用成8M Urea會改善嗎? 謝謝各位囉^^
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◆ From: 140.112.79.199
1F：推 rurica:理論上用 imidazole 流洗下蛋白質後 Ni 還會留在 column 04/23 20:27
2F：→ rurica:所以變白是不正常的 再來就是 你的 gel 跟 GE 的 04/23 20:28
3F：→ rurica:不見得一樣 所以我也不知道他能耐到多少 04/23 20:29
4F：推 ycyyyy:我用過磁珠純化過inclusion body 效果很好 可以試試 04/23 22:46
5F：→ Nox4156:請問磁珠是怎樣的純化方式呢? @@! 04/23 23:13
6F：推 alaric:buffer pH 檢查一下, 可能變太大了... 04/23 23:41
7F：推 qoopig45:那個wash的imidazole的濃度是參考廠商說明書的建議? 04/24 01:04
8F：推 sqqs:先配好1M imidazole stock solution, pH要調到8.0左右 04/24 01:12
9F：→ sqqs:cell lysate裡頭不能含有EDTA或EGTA ，因為會吃掉Ni 04/24 01:15
10F：→ sqqs:Ni-NTA purification under protein denaturation conditon 04/24 01:18
11F：→ sqqs:是不需要用imidazoole的....最好先詳讀manual 04/24 01:21
12F：推 bluejelly:假如沒記錯 Ni-NTA manual不建議用這麼高濃度GnHcl 04/24 08:24
13F：→ bluejelly:可試8M Urea 另外和gel incubate後 wash前的flowthrough 04/24 08:24
14F：→ bluejelly:有留下來檢查嗎? 可排除在binding step就出問題的可能性 04/24 08:25
15F：→ bluejelly:另外Ni-NTA純化denature蛋白質是可以加imidazole的 04/24 08:26
16F：→ bluejelly:manual上雖沒建議但若有其他non specific binding 04/24 08:26
17F：→ bluejelly:也可加 04/24 08:27