作者aggaci (小提琴的連弓真的好難阿)
看板Biotech
標題Re: 有關純化的問題
時間Thu Apr 17 15:58:53 2008
※ 引述《aggaci (小提琴的連弓真的好難阿)》之銘言：
最近從pichia medium收集蛋白質
因為量太多了
所以我用80%的硫酸銨把它抓下來後
過nickle resin進行純化
等到我覺得我洗的很乾淨了，再以高濃度的imidazole 進行 elution
出來的都黃黃的，根據以前的經驗，通常降子蛋白質都很多
但是以20 micrliter跑電泳只有一點點，沒什麼雜蛋白
(western blot結果是有東西的)
後來拿去dialysis 顏色也沒變淡.....
那顏色到底是什麼造成的？(濃縮後變成深咖啡色)
拿去用BCA測濃度 測出來有10mg/ml.........Orz..
拿來跑電泳根本沒那麼多
因為我第一次做皮奇亞的實驗，所以很多都不太懂
有沒有高手能指導一下哩
謝謝
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◆ From: 140.114.100.165
1F：推 Ren:probably contains metal(s). Use UV-VIS to test OD 300-500 04/17 02:16
直接測嗎？不需要加任何reagent嗎？
2F：推 ROKEE:這東西超臭的XDDD 原po原敲完硫銨、透析後有過mino-pore?? 04/17 07:52
3F：→ ROKEE:那些可能是代謝產物,畢竟這是可以長到OD600=200的菌 04/17 07:53
4F：→ ROKEE:而且產量不高的原因很多,medium.菌株.methonal誘導時間,etc. 04/17 07:55
5F：→ ROKEE:更正 mini-pore, methanol (爛鍵盤害我一直打錯= = ) 04/17 07:56
請問你說的是過0.2 filter嗎？
6F：推 pichia:當初transfromation時候 有用Zeocine挑表現量較高的菌株嗎 04/17 11:37
我的vector是pPIC9，不是抗zeocine
當初有幾顆都有表現(小量) 我是挑表現量最多的去大量表現
而且很多都在胞內....Orz..有種衝動想把他打破純化...="=
7F：推 cypher0623:哇~ 本尊都推文了 04/17 12:49
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◆ From: 140.114.100.165
8F：推 jjlee:打破純化你會哭... 雜蛋白質多到要extra colunm來去除 04/17 21:13
9F：推 sqqs:分泌蛋白的glycosylation也要考慮 多年前我看過paper 04/17 23:51
10F：→ sqqs:有提到glycoprotein比較不易被comassive blue染出來... 04/17 23:54
11F：→ aggaci:真的嗎？！？請問是哪一篇paper...?明天我來找找看，找不到 04/18 01:49
12F：→ aggaci:再請教你~~ 04/18 01:50