作者nonononoy (...)
看板Biotech
標題[求救] IP和antibody的使用
時間Thu Apr 10 14:33:11 2008
這個實驗我做很久了還是做不出來
希望有經驗的大大可以給我建議，狀況來了，請接招
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狀況來了的分隔線 狀況來了的分隔線 狀況來了的分隔線
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我想要用western blot看一個endogenous的protein expression
不過這個protein目前市面上沒有賣，所以我們lab由我來純化蛋白(含HA-tag)
做出hybridoma之後拿去打老鼠，從其中腹水大量取得之後要用的ab
經過用western blot測試，我的ab是可以用在這個蛋白的偵測
因為這個protein在細胞中的表現量很低，一直沒辦法直接測到endogenous expression
所以老闆建議我用IP-western的方法，也許可以得到結果
在還沒開始進行實驗前我想說先找到這個ab做IP最好的條件
所以我先做transient transfection，
positive control用anti-HA ab來做IP (5ul of ascites in 1 ml RIPA) O/N
我自己做的ab在一樣的條件下也是加5ul做IP
western出來的結果是看不到我要的band，不過positive有出來
想說也許是epitope躲在內部，所以我也試過先denature protein再IP
不過還是得到一樣的結果，各種IP的protocol我也試的差不多了
不知道各位有什麼建議?
為什麼western可以用的ab在IP就不能用了?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 75.47.195.107
1F：推 oddball:我猜 因為western的ab是認直線狀的peptide,可是IP要認的 04/10 15:37
2F：→ oddball:是conformation (native protein),所以才會有此差異 04/10 15:38
3F：推 aggaci:IP認的不一定是結構... 04/10 16:27
4F：推 leoblack:你的denature protein是怎樣denature?!+2-ME?100度煮過?! 04/10 18:49
5F：推 chvkimo:你的immune用的protein是用peptide 還是 whole protein? 04/10 23:48
6F：→ nonononoy:我是有加2-me，也有煮，ab是用whole protein去製造的 04/11 02:25
7F：推 leoblack:恩~看起來會是同1樓說得那樣~認的conformation不同,一個 04/12 11:47