※ 引述《cytospin (無心)》之銘言： : 請問一下比較好的Co-IP lysis buffer使用什麼比較好 : 現在我就是用普通的lysis buffer (Tris, NaCl, EDTA, 10%glyceral, 還有一堆inhibitor) : 可是做出來效果不是很好 : 想說會部會我的lysis buffer太強了 (我似乎有看到有人用tritonX-100做) : 把pt-pt interaction也都打破了 : 我的做法如下: : 1. 3x 10^7 cells lyzed in 500 ul lysis buffer, 4C, rock for 45 min : 2. Spin down 20 min : 3. sup preclean with Trueblot anti Rabbit beads 30 min : 4. Add 5 ug of primary Ab, 4C rock O/N : 5. add 50 ul beads 1hr, rock , 4C : 6. wash twice, : 7. add 2 X loading buffer , heat 10 min : 8. spindown, loading : hmm.....大概就是這個樣子 : 請問Co-IP達人 : 有沒有比較好的建議?? 你可以把你的lyse buffer每種成分的濃度PO一下嘛 像salt(NaCl)濃度在IP時會影響protein-protein interaction detergent也會 另外，lyse和IP時的濃度也會有差 如果你說你上述的NaCl和detergent都沒有調很高 那可能就是lyse時你要的protein大部分沒有溶出來 或是你的protein的sublocalization很多種(核內核外膜上) 以我的經驗，NaCl一般都是用150-200mM即可 Tx-100用0.1或0.2都可以 不管lyse or IP都這樣的condition即可 如果要看的CoIP條件是針對hydrophobic interaction而言 那可能還要再調整了 這是比較特別的例子^^ --

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