作者kvw (Je t'aime)
看板Biotech
標題[求救] 有關cloning的問題
時間Fri Mar 14 00:56:11 2008
最近在做cloning
所要insert進去的片段大概是1700 bp
所使用的是p-GEMT easy vector
前面都很順利
後來挑了white colony
抽plasmid後 用PCR做confirm(老闆說這樣比較省錢)
結果出來 完全沒有insert
初步排除是X-Gal出問題
因為有藍有白還蠻多的
而其他inser進去的片段是400 bp的都成功
唯獨這個大片段的 挑了快20個white colony都沒有insert進去
有沒有人遇到這樣的情形 拜託幫幫忙
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.90.48
1F：→ chvkimo:再多挑一些看看吧 03/14 01:44
2F：推 bluecsky:這套我用過也做過2k左右的insert..有一些小訣竅 03/14 08:44
3F：→ bluecsky:例如放到4度冰箱冰一個小時加強表現 03/14 08:44
4F：→ bluecsky:或是可以延長一點ligation的時間 03/14 08:46
5F：→ bluecsky:還有挑的時候可以再拿更多colony..反正是跑PCR 03/14 08:46
6F：→ bluecsky:看看那精美的96孔盤...你知道我的意思吧 03/14 08:47
7F：推 enisx:為何不直接作coloy PCR? 另外 ligation放室溫 o/n 試試 03/14 09:46
8F：→ enisx:另外 樓上說的對,一次挑 就挑96個,多挑個幾盤總會有一兩個! 03/14 09:48
9F：推 bluecsky:樓上沒說我還沒發現他是抽plasmid做PCR.. 03/14 10:01
10F：→ bluecsky:做colony PCR就好了..比較方便 03/14 10:01
11F：推 oplz:有做 PCR positive control 嗎? 03/14 11:39
12F：→ kvw:已經有放在冰箱快3小時了~藍白還蠻明顯的~ 03/14 12:08
13F：→ kvw:沒有做positive control 不過其他盤都是有出現insert成功 03/14 12:08
14F：→ kvw:大家都建議挑多一點 可是今天又再挑了快12個 還是沒有~ 03/14 12:09
15F：→ kvw:老闆說這樣太不划算了 要看看問題在哪再做 實在很苦惱 03/14 12:11
16F：推 dankai:換一個抗生素~~~ 03/14 13:12
17F：推 Janeliuu:Clone 到別的 plasmid 試試....不一定要用 pGemT 03/14 18:04
18F：推 enisx:挑12個就要有對的要蠻運氣地~ 03/14 20:47
19F：推 bluecsky:怎麼會不划算呢..不要抽plasmid做colony PCR 03/15 07:46
20F：→ bluecsky:不用半天就能screen上百個colony..快又方便XD 03/15 07:47