作者arzakiii (Isopotenal)
看板Biotech
標題Re: [求救] 抽RNA定量問題
時間Tue Jan 29 02:33:49 2008
※ 引述《qkenny (想變白的巧克力)》之銘言：
: 請問一下
: 一般細胞是抽完RNA然後定幾個microgram下去做RT?
一般做RT都是買kit來做
kit上面都有很詳細的說明
您看上面一定有講說跑RT您所需要加入的濃度是多少
: 還有若是有感染RNA病毒的細胞
: 在測吸光值的時候 RNA量會特別高
: 那定RNA總量下去跑
細胞被病毒infect以後分兩種途徑
一種是病毒會拼命的讓細胞製造病毒
這樣細胞的RNA的濃度當然會上升
不跑RT只做定量的話
只能證明說妳的病毒可能真的有infect細胞
: 例如:定2 microgram total RNA 若測吸光值為6000ng/ microL
: 一般細胞沒感染的話在1000多
: 那不是細胞的RNA相對變少
: 是不是就不能用actin去定量?
: 那有什麼定量的方法?
: 謝謝
actin是housekeeping geen
基本上不管病毒有沒有infect應該都是固定量
所以才會常被用來做interal control
當然可能有少數會影響actin的病毒
如果您的病毒前人已經有做過
可以自己去查一下reference
如果沒人做過
用RT測試一下就知道您的actin有沒有被影響嚕!!
定量的話我都是用spectrophotometer
我是沒用到actin
用到actin通常是跑膠才會用到
如果純粹只是要定total RNA只需要用spectrophotometer
就行啦!!
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◆ From: 220.139.74.41
1F：推 lanth:不同的細胞種類用不同的internal control 01/29 09:33
2F：→ lanth:例如肝臟再生時常用是beta2 microtubulin 而不能用其他的 01/29 09:33
3F：→ lanth:所以要選一個大家認可表現量不會改變的 比較適合 01/29 09:34
4F：推 qkenny:謝謝 我是想說若有細胞株對病毒感受性不同 要怎樣做出來的 01/29 20:47
5F：→ qkenny:圖 PCR後 可以看到actin的band量相同 而病毒的band量不同 01/29 20:50
6F：推 qkenny:所以想問抽RNA 後要怎樣定量做cDNA 跑PCR才有那樣的結果 01/29 20:54
7F：推 lanth:要不要試試看不要管actin,DNase處理後的RNA拿去測吸光值 01/30 08:39
8F：→ lanth:再跑膠確定濃度真的調整成一致 然後再轉cDNA 01/30 08:40
9F：→ lanth:建議不用actin的原因是說不定病毒感染會改變actin表現量 01/30 08:42
10F：→ lanth:而且細胞株不同 actin的表現量應該會有所差異 01/30 08:44