作者cyken (Ken)
看板Biotech
標題Re: [求救] Cloning 的問題
時間Tue Jan 22 00:18:45 2008
※ 引述《canongirl (變 世上唯一不變)》之銘言：
: 大家好，目前我手上有一個clone 要做
: 老師請我先去合兩條primers 有53mer
: 序列(舉例)： primer1：5'ATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...3'
: primer2：5'TAGCGCACTATACACGAGTATCGA...3'
: 也就是兩條完全pair，因為這53mer其中包含我要clone的insert 另外有兩端各有BamHI
: 的切位可以接在vector上
請你仔細看一下, 你上面設計的primer根本無法正確地如你希望地 anneal
正確的primer應該要互為 reverse complement
primer1：5'ATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...3'
primer2：
3'TAGCGCACTATACACGAGTATCGA...
5'
若要設計兩端為 BamHI , 並不需要用到BamHI去切
你可以設計成這樣
primer1：5'
GATCCATCGCGTGATATGTGCTCATAGCT...
G 3'
primer2：
3' GTAGCGCACTATACACGAGTATCGA...
CCTAG 5'
接下的實驗步驟給你參考一下,這是我常用的方法:
** 方便起見 microM 表示為 uM , microliter表示為 uL **
1. primer稀釋成 10 uM的濃度
2. PNK reaction: (用500uL或200uL的eppendorf)
primer1 (10 uM) 1 uL
primer1 (10 uM) 1 uL
PNK buffer (10X) 1 uL
ATP (10 mM) 1 uL
T4 PNK (? units) 1 uL *隨廠牌不同,活性單位會有不同算法和濃度
通常不會特別去精算用量,直接加 1 uL
dd water 5 uL
----------------------------
Incubate at 37度C , 1 hour
3. PNK之後,直接拿去做anneal,最方便的方法是用PCR machine,
所以PNK的時候用500uL或200uL的 PCR eppendorf,就可以直接上機
設定你的PCR machine:
95C,5min -> 65C,5min -> 45C,5min -> 25C,收
4. 切你的 vector DNA, 例如你這邊用的 BamHI,
只切一個enzyme的話,記得要再做 CIP,以免 self-ligation
然後run agarose gel純化 DNA
這一個步驟其實跟一般的cloning都一樣,有問題的話向實驗室學長姐或老師請教
5. Ligation :
PNK並anneal之後的DNA不需要純化,可以直接拿來做ligation
vector DNA ~100 nanogram
annealed primer 1 uL
ligase buffer xx uL
T4 DNA ligase x uL
dd water xx uL
這個步驟就跟一般的ligation一樣, 實際反應體積就看你的vector DNA濃度來調整
ligation的溫度和時間各家作法不一,用你習慣的方法去做就好
===================================
以上獻醜了, 歡迎各位板友的批評與指教。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.169.106
1F：→ cyken:補充:盡量不要用單一個RE做 cloning 01/22 00:45
2F：→ cyken:容易發生self-ligation,反向insert,和多重insert 01/22 00:47
3F：推 bluecsky:沒錯..單一RE site cloning麻煩多多.. 01/22 04:18
※ 編輯: cyken 來自: 140.109.32.9 (01/22 14:02)
4F：→ cyken:今天算了一下濃度,insert濃度太高,所以修了文 01/22 14:02
5F：→ cyken:100uM -> 10uM ; 95C10min -> 95C5min ; insert 2uL -> 1 uL 01/22 14:03
6F：→ cyken:100uM是我在做 3-piece ligation 用的濃度 01/22 14:04