作者sGoat (無三小羚羊)
看板Biotech
標題Re: [求救] 請問有關PCR的問題
時間Thu Jan 17 19:29:03 2008
※ 引述《annesamuel (as)》之銘言：
: ※ 引述《annesamuel (as)》之銘言：
: : 我的sample跑出還的長度大約 0.5Kb
: : 如果annealing temp 提高 negative control 的band就不見了
: : 但我的sample跑出來的量就非常少非常少
: : 有的sample甚至跑不出來
: : primer dimer的可能性也有考慮過
: : 也有請我學妹做 結果也是一樣
: Negative control 的水是用0.2micrometer濾紙過濾再滅菌的二次水
: 引子 (primer)
: Forward --- 968fgc序列 ： 5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG
: GCG GGG GCA CGG GGG G
: AACGCGAAGAACCTTAC-3’
: （with GC clamp）
: Reverse ---1401r序列 ： 5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
: primer dimer 應該不會0.5Kb 這麼大吧
你的forward會形成幾個不容易解開的hairpin...
reverse倒是不錯...
對於你0.5k的band我想可能是你forward的hairpin造成的...
自己黏自己就形成template跟primer了(爆)
因為你在文中有提到將溫度提高就不會出現...
但是因為你提高的溫度可能造成你reverse的primer黏不上去...
所以提高溫度的作不出來...
所以我的建議是...
如果你能確定產物哪個是你要的,而且這個過程不需要漂亮的電泳圖的話...
就挖你要的東西出來用就好了...
(或是縮短anneal時間,或是加入DMSO解開二級結構,參閱5622推文的sil大)
或是將你提高anneal溫度的PCR條件增加cycle數(不要超過總數35cycle)...
再做不出來就把你P完第一次的產物稀釋5-50倍當作template再進行PCR一次...
條件跟第一次一模一樣,也是要用提高anneal溫度的條件做,當然premix都要加...
再來是龜毛的解決辦法...
將你的forward縮短,盡量使它跟reverse的條件一樣...
GC值,Tm溫度,長度,其中又以Tm溫度最重要(其他作參考)...
再將設計好的primer用DNAStar或是DNAMAN這類軟體計算dimer與hairpin...
盡量取最好的一組使用...
反之...要是你的forward是不能變更的話,請加長reverse...
還有更龜毛的是你以上方法都試不出來時可以用的...
不過這個還是等你都用不出來再跟我問吧...
希望有幫上忙...
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◆ From: 61.221.60.215
1F：推 bider:配合touchdown? 01/18 00:52
2F：→ sGoat:他的情形使用touchdown會有點麻煩,即使primer分2次P還是麻煩 01/18 09:28
3F：推 annesamuel:我anneal的時間只有1分鐘可以再縮短嗎 01/18 20:37
4F：→ annesamuel:請問DMSO可以高溫高壓滅菌嗎 要加多少 01/18 20:39
5F：→ annesamuel:我的cycle數已是35且已是Nest PCR 01/18 20:41
6F：→ annesamuel:forward primer的設計是為了往後用DGGE分析PCR product 01/18 20:43
7F：→ sGoat:anneal可以試試10~30秒,DMSO要問sil大(不然加1μl看看) 01/19 20:23
8F：→ sGoat:那試試看加長reverse吧,這樣就可以變成touchdown 01/19 20:27