※ 引述《reteporeh (颱風也喜歡放假)》之銘言： : 想請問板上的各位 : 有將PCR產物做膠回收然後再進行PCR嗎? : 目前遇到的情形是 : 膠回收完的產物再進行相同條件PCR時 : 在跑膠確認時,沒有看到任何的band : 重複做過幾次,情形依然 : 想請問在做完膠回收後 : 再進行PCR時 : 有什麼條件特別要求的嗎? : PS..膠回收是使用Kit做的 sorry... 我的意思是為什麼要在PCR完之後跑膠回收"再跑一次PCR"... (膠體回收也要看的到產物在哪裡吧?純粹猜測位置再切膠回收要是沒產物不就做白工?) 假使你的primer設計得夠專一的話... 單純考慮擴增量不夠... 將你的PCR產物稀釋50倍之後再以同一組primer進行PCR擴增... (甚至是使用更專一的Nest primer擴增) 就能將你第一次沒被放大到可見程度的產物再放大一次... 一直持續到你所要的產物被放大到你要的量... 假設是擴增要進行ligation的片段... 那你的RE切位一定設計在primer上... (此句修正,要外加切位才是在primer上) 在沒有產物的情形下,為何不先考慮PCR是否成功? 再假設你進行了PCR擴增ligation的片段... 你得到了產物,你將產物以RE切過了 跑了膠回收完,你想要確認回收到的是不是你要的片段... 因此以相同的primer又跑了PCR想說要是同樣的東西應該有東西會P出來... 可是你的template上primer相對應的黏接位置已經被你用RE切掉了... 那你怎麼能夠預期PCR能夠P出東西來呢? --

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