作者yingchi (腦殘無極限)
看板Biotech
標題[求救]IHC的background消不掉
時間Thu Dec 27 17:12:27 2007
小弟目前正在做一些石蠟切片的IHC，
所使用的是VECTASTAIN 的ABC kit，以及利用DAB呈色
染完之後，再利用Hematoxyline做細胞核的染色，
現在主要有兩個問題：
(1)經過DAB呈色後，整個組織都會呈現紅褐色，顯微鏡下，也看不太到明顯特別黑的區域
我呈色時間只用一分鐘。
(2)利用hematoxyline染色，卻染不出細胞核，而整個組織顏色用肉眼看也與DAB染色後
沒有差距，理論上不是應該要變成藍色嗎？
在此，想請問有經驗的前輩，
我看過期刊裡面的IHC，他們所貼出的照片，Background似乎都會呈現藍色，
但是我現在卻做不太出來，反而是整個組織呈現紅褐色，
我也試過用commercial的blocking buffer，
仍然無法解決這樣的問題，
還請各位指教
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.40.11
1F：推 oopa:如果方便可以提供你是用哪種組織及blocking的條件,會比較 12/27 18:44
2F：→ oopa:容易找問題,或許有些人有類似的經驗 12/27 18:45
3F：推 oopa:background可能來自組織本身的biotin,此時就要從blocking著手 12/27 18:47
4F：推 everything47:你的組織本身就有顏色嗎? 會不會是過染了? 12/27 19:34
5F：→ everything47:如果是過染 把一抗的比例調低試試 12/27 19:35
6F：推 roddic:你有做antigen unmasking嗎? 12/28 10:42
7F：推 lanth:用citric acid unmasking後background會較高 可以調高 01/02 17:12
8F：→ lanth:blocking serum的濃度 以及blocking的時間 01/02 17:12
9F：→ lanth:另外固定的時間不可以過長(>24hr)否則會讓該出來的出不來 01/02 17:14
10F：推 lanth:還有antigen unmasking的方法有好幾種 要參考一下抗體的 01/02 17:18
11F：→ lanth:data sheet 選用最適合的方法 01/02 17:19
12F：推 lanth:Hematoxylin 也有許多種 以前我適用Mayer's hematoxylin 01/02 17:23