※ 引述《wensing (潛力股)》之銘言： : ※ 引述《bluehttp (蝦毀)》之銘言： : : 最近在做cloning, : : 做到快發瘋了. : : 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs), : : 去切 insert 和 vector, : : 跑電泳也確定有切動, : : 之後用T4 DNA ligase 進行 ligation, 然後overnight, : : 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,塗plate, overnight. : : 可是隔天來看沒有長..... : : 我有試過用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase, : : 可是一樣都沒長, : : 不知道尚有哪些細節我沒注意到, : : 希望有經驗的大大可以幫助我阿! : 1. 切的時候 是一起混切？ 還是先後切？ : 2. 切完後 再經膠體純化後，DNA sample 是否還在？ : 3. ligation時，大小片段混合後，加入buffer前是否先45℃加熱再冰浴？ : 全程是否冰浴操作？有沒有再額外加入1mM ATP? 大小片段混合比例是否正確？ : (po 一下 你的步驟) XhoI跟HindIII是可以合切的 用2號的樣子 雖然我是比較喜歡先後切 切完後膠回收 然後膠回收的產物回溶後取等量下去跑一片膠 再依band的亮度決定ligation的vector:insert 我習慣是... vector跟insert的亮度去除以長度得到莫耳比 vector:insert 最好是1:3~5 例如 　　　Ｖ　　：　　Ｉ 亮度　１　　：　　１ ---------------------------- 長度　５　　：　　１　　 這時候代表膠回收的產物濃度vector:insert大概是1:5 所以直接取1:1體積的vector跟insert下去ligation ligation時先將二次水 vector insert加熱45℃ 5分鐘 於冰上待涼後 加入ligase跟buffer 這裡要注意buffer ligase buffer會有ATP在裡面 通常存於-20時會有白色沉澱 使用時務必要把白色沉澱溶解 (用震的) (我記得這是ATP的沉澱...好像有點怪...) 之所以會有額外加ATP也是這個考量...怕沒溶或degrade... --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.208.5 那時候翻Molecular clone是說37℃ 5~10分鐘 詳細原因我倒是不知道 後來實驗室的protocal就被改成45℃ 也沒有原因....@@... ※ 編輯: greenmoon00 來自: 140.120.208.3 (12/14 14:00)