作者cothuho (cothuho)
看板Biotech
標題Re: [求救] cloning 救郎喔~~
時間Wed Dec 12 13:41:22 2007
※ 引述《bluehttp (蝦毀)》之銘言：
: 最近在做cloning,
: 做到快發瘋了.
: 我用 XhoI 及 Hind III (biolabs),
: 去切 insert 和 vector,
: 跑電泳也確定有切動,
: 之後用T4 DNA ligase 進行 ligation, 然後overnight,
: 隔天再transform (DH5a),recovery 1hr,塗plate, overnight.
: 可是隔天來看沒有長.....
: 我有試過用 fermentas 的 ligase 及 biolabs 的 ligase,
: 可是一樣都沒長,
: 不知道尚有哪些細節我沒注意到,
: 希望有經驗的大大可以幫助我阿!
你的insertion 和vector長度比如何？
長度接近 且insertion較長時 也比較難ligate
另外 你的vector有沒有放夠量
至少也要100ng 比較保險
別只看膠上跑的粗細來判定 去測測濃度吧
DH5a細胞數不要太高 會影響transformation
若要塗的細胞有點多 塗到兩個plate上 以免死亡的細胞抑制resisitent的細胞
另外vector有去磷酸化嗎？ 試試看不要做去磷酸
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◆ From: 24.145.137.213
1F：→ bluehttp:請問磷酸化的意義 12/12 19:54
2F：推 gloclovlo:應該是指vector做TSAP處理吧 12/12 20:15
3F：推 wensing:應該是insert 要 磷酸化 保護，避免轉入後，被菌吃分解 12/12 20:57
4F：推 enisx:樓上你確定你講這樣對嗎? 12/12 21:11
5F：推 wensing:抱歉，我一時想錯了！ 是 甲基化 12/13 01:28