作者sinlu (懶的換暱稱!!)
看板Biotech
標題[討論] 請問有關reai-time PCR
時間Tue Dec 11 22:41:30 2007
大家好^^
目前是新手 在做real-time PCR遇到一些困難
我用的是Taqman的方法
probe以及primer都是用前人所設計出來的
我目前就是跟某家公司定他之前所設計出來的序列去跑
我遇到一些問題
就是我跑出來的曲線Ct值OK 反應結果如預期
但是 它的曲線卻都會呈現有點彎彎曲曲
不是像普通別人的圖那樣 可以很平穩的上昇
我有打電話給那家公司
他們是說我加入的probe濃度可能太高
所以 我也有做了5x 10x 100x 1000x的序列稀釋
5x結果是有比較好 但是還是會彎彎曲曲的
後來 我想過是不是我一開始用TE去溶解probe的原因
所以 將probe的stock 拿水稀釋重做
情況也沒有改善
第三次 使用經PAGE純化過的primer去跑
其實本來就應該用比較高品質的去跑
只是之前用光了 所以後來定新的primer
跑過後 也有好一點 但彎彎曲曲的情況還是有
我不太清楚是哪種原因
曾經想過 我技術不好
或者是那間公司probe沒做好(好像是新代理的公司)
或者是本身probe-primer就設計不良?
另外 我都有做過只放probe對照組
發現它螢光量 一開始就十萬多 之後才慢慢降
因此 才會想過是probe的原因
請問大家有這種經驗嗎@@?
實驗試過各種方法 卻一直沒辦法做好
謝謝解答^^
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◆ From: 220.139.214.163
1F：推 qqo8855436:是 abi roch biorad 哪一家的?? 12/12 18:44
2F：→ sinlu:ABI的 12/13 12:09
3F：推 qqo8855436:他們taqman分析不是看顏色嗎?? 為什麼要看曲線?? 12/13 23:51
4F：→ sinlu:要看螢光量增幅的曲線@@ 我都是看這個 跟螢光上升的量 12/14 23:49
5F：推 qqo8855436:你是要定量還是分型的勒?? 12/15 02:35
6F：→ sinlu:定量的為主吧@@ 主要是偵測它在植物內含量的多少 12/15 23:47
7F：推 qqo8855436:方便的話貼圖檔我還蠻想看到他是怎麼歪的 ^^" 12/16 01:41
8F：推 wa478478:貼圖...想像太模糊啦..... 12/21 13:23