作者tsubasawolfy (悠久の翼)
看板Biotech
標題[求救] Phosphoprotein的western
時間Mon Dec 3 12:02:59 2007
最近新買兩隻QIAGEN的Anti-phosphoserine跟Anti-phosphothreonine弄得很困擾- -
因為Background一直過高．．．(第一片海苔就獻給它了．．)
高到肉眼就可以看見membrane整片都發光(serine最嚴重)
不過band還是可以看的清楚(３０秒以下可以 壓３０秒以上就會無法辨認)
Blocking跟一抗二抗的條件都照它Hand book寫的操作
Blocking:1X TBS, 5% BSA,RT,2hr (hand book是寫1hr..至於RT跟4度C都試過 沒有差異)
First Antibody:1X TBS,5% BSA+0.1%Tween 20, 4度C, O/N
(Serine-mouse IgG,IgM Threonine-mouse IgG)
Second Antibody:1X TBS, 10% milk+0.1%Tween 20, 2hr
(Cell signaling, Anti-mouse IgG)
做膠跟跑膠的buffer也都重配(running buffer跟transfer buffer不回收)
hand book的trouble shooting也只寫background過高是因為BSA blocking能力不好
所以二抗才會用10%milk補強(也沒寫解決方法= =a)
目前自己有嚐試過降低１抗濃度 從廠商預設的1:100-1:200降到1:500
不過海苔還是一樣一分鐘就烤好了Orz
還有幾個方案(還沒試)
1.提高blocking跟一抗的BSA濃度(5%->10%)
-這不知道有沒有用..
2.blocking時間延長
-這感覺比較沒用 因為一抗也是用同濃度BSA配還overnight
3.一抗濃度降更低 1:1000試試看
4.一抗不要O/N 試個2-4hr看看
目前就只想到這幾個 不知道還有沒有哪位先賢可以提供一下其他改進意見..Orz
(買新抗體除外= =)
ps至於是否可能二抗亂抓的問題．．有用其他Antibody測試過沒有亂抓的問題
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◆ From: 124.8.178.224
1F：推 blence:你有沒有想過BSA其實都是有phosphorylation的form? 12/03 12:43
2F：推 racher:我以為是caseinh才會有phosphorylation form耶!! 12/03 14:28
3F：推 tsubasawolfy:一樓的問題我有想過 但是他hand book上面沒有寫明 12/03 16:31
4F：→ tsubasawolfy:要哪種BSA..所以我是直接買新的SIGMA-BSA 98% 電泳級 12/03 16:31