※ 引述《foureyes ()》之銘言： : 從九月開始就在作構築質體的動作 : 老師要我用 PCR 夾出 insert 片段　 : clone 到 pET32c 上面後 transform 到大腸桿菌裡面去做表現 : 我 transform 完後在 LA plate 上有長出菌落 : 我以為這樣就表示有接到? 因為之前曾經長不出菌落過 : 然後挑菌落轉養後抽質體確認 : 用與 digest 時相同的酵素 HindIII & NdeI 來切 : 37度C 反應 2小時15分鐘 : 跑電泳卻沒有看到理論上一大一小的片段 : (我的小片段應該是 500 bp 左右) : 已經重複五六次了都沒有看到小片段 : 請問這表示我根本從頭到尾都沒接到嗎? : 我看有人說用兩種酵素的話要分一前一後處理 : 我是兩種酵素一起加下去 : 會是這個原因所以切不出來嗎? : 還是有其他的問題? : 先謝謝大家了(跪) 阿..都重覆了5 6次了.. 而且你digest的時間都這麼長了 不應該有切不出來的現象(除非你enzyme加真的很少很少..應該不可能吧) 就相信他吧..乖乖去重新ligation一批吧.. 有長不一定是你有接好轉進去 很多時候都是false positive.. 假如你之前的都沒長colony的話 建議你從抽vecoter跟PCR insert這邊重新開始 把整個實驗都重新setup一下 做construct就是這樣..反正一直做不出來就從頭開始再弄一次 有時候就會出來了 我一般enzyme digest是用來做二重確認才做的 第一步都是用PCR screening 直接用牙籤點一下colony然後再點一下到PCR的管子中 加入適當的primer跟buffer dNTP Taq..就開始做了 (primer我會選insert的forward primer跟vector上的reverse primer) 一次可以快速的screeningㄧ堆 再把screen出現positive結果的在點去養broth 之後才用enzyme digest做第二次確認 大多兩種enzyem各1 ul..用於total體積20 ul 切一小時 就很夠了 -- 啊！我們真的是拼圖(喘) ╭╮ ˊ ┌──┬┘└┐ ╭┘ ╭┘ │ ╰┐╭╮┐╭╮│)) └┘└┴┘└┘ --

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