作者kvw (Je t'aime)
看板Biotech
標題[求救] 要做長片段的PCR
時間Thu Nov 29 11:58:42 2007
最近要夾一個片段
估計裡面是有intron存在
因為用cDNA是可以夾出來
但是換成genomic DNA就不行了
跑完膠後乾乾淨淨 一點東西都沒有
想說可能是片段太長了
有爬文看了一下 不過還是不太懂
如果將Taq換成Pfu可以改善嗎?
我們家是用invitrogen的Taq DNA polymerase
還是我將extension時間拉長就可以了? 目前是設定 3 min
那dNTP的濃度要提高嗎? 目前是2mM 5ul
希望大家可以幫我解答一下 拜託了謝謝
p.s大小預估是4kb 這樣普通的Tag有能力做的出來嗎?
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.90.211
1F：推 HIbaby:如果太長, 我會做兩條, 在把兩條接起來 11/29 12:02
2F：推 nixo:也有專門作長片段的taq。或是多作幾個primer組合確認一下。 11/29 12:22
※ 編輯: kvw 來自: 192.192.90.211 (11/29 13:25)
3F：推 HCCY:Pfu產量比Taq還差耶 可以用fusion pcr 11/29 13:32
4F：→ HCCY:最簡單的還是如樓上所說 做兩條接起來 11/29 13:33
5F：推 biologydream:我有夾過3K,用的是taq+pfu 1:1混合,並加DMSO增進產物 11/29 13:44
6F：推 konlon:pretreat with suitable restriction enzyme 11/29 19:15
7F：推 elderbear:我用過百力的blend taq作3.5kb...產量多又專一喔 11/30 12:23
8F：推 handoluslash:我之前經常作5K的片段用的是hotstart Taq 12/01 11:55
9F：→ handoluslash:也是加DMSO增加效率 不過濃度是2% 12/01 11:57