作者jeff20628 (goddtv)
看板Biotech
標題real time PCR遇到問題!!!
時間Wed Nov 28 21:49:51 2007
我將老鼠組織抽其RNA,抽RNA過程有使用到phenol跟chloroform,
抽完後,做RT,然後做real-time pcr,
第一次這樣做都沒出現任何問題,基因也做完了,
然而老師要我再做另一隻老鼠,一般實驗都會做兩隻以上一樣情況下的老鼠基因PCR,
於是這次我一樣抓另一隻老鼠,方式同第一次,抽完RNA做RT,
重點是RT做完後,我就先用一般的PCR先看RT有沒有成功,我GAPDH放大約19 cycle就
pcr出來了,於是我就去做real time pcr,奇怪的事出現了,居然偵測不到,
第一次做GAPDH大約在15~20 cycle之間就可以PCR出來,但是這次real time pcr
我調到44cycle,居然也看不到GAPDH這個基因,這只是我的control而已阿> <
我再回去用一般PCR機器(加的enzyme是taq),的確在19 cycle就pcr出來,
但是real time pcr就是失敗!!!
重點來了,我拿上去的template來做,的確GAPDH在15 cycle左右就出現曲線了阿,
為何這次的template居然在rt-pcr可以成功p到GAPDH,但是用real time pcr就失敗= ="
怎麼說都搞不懂,如果RT失敗,應該連一般PCR都失敗阿,為何只有REAL TIME PCR失敗阿
高手救我阿,還是我有phenol或chloroform些微殘留,卻只會影響real time pcr的螢光
enzyme,一般的enzyme都不會影響???real time pcr的enzyme是不是比較脆弱阿= ="
救我阿 做到快哭了 還是重抽RNA,然後小心一點= =
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.115.48.75
1F：推 NKTcell:會不會是real time的reagent出問題了 or PCR過程中用到的ꨠ 11/28 22:23
2F：→ NKTcell:東西已經被汙染 11/28 22:24
3F：推 jeff20628:因為我有用之前的template去試,可以正常p出來 11/28 22:47
4F：→ jeff20628:所以目前發現只有template有問題,但他用一般pcr卻可以 11/28 22:48
5F：→ jeff20628:P出GAPDH= =? 11/28 22:48
6F：推 laba72:不好意思.請問妳有聽過 CapSwitch oligonucleotide 11/29 19:28
7F：→ laba72:因為之前書報的PAPER有看過..但看不懂他的意思 11/29 19:28
8F：推 fungihsu:請問是用Taqman還是SYBRGreen? 12/01 18:15