作者wangba (原來...)
看板Biotech
標題Re: [求救] transformation的問題
時間Mon Nov 19 14:18:33 2007
※ 引述《bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)》之銘言：
: 用PCR的方式就是你要重做整個insert
: 也就是你要做his-tag+insert這整個DNA
: 不過似乎跟你原本想要的方式又多了一道手續
: 因為必須重新PCR做insert
: 這樣接好之後還是必須重新送定序
: 要是原本的gene長度比較長..有時候會容易出現一些mutation
: 假如是要用his-tag..為什麼不找方便的切位直接切下
: 接到含有his-tag的expression vector呢?
: 因為如果真的只有24 bp的話..
: 我還沒接過這麼小的XD..不知道會不會有什麼問題產生
如果怕PCR會產生mutation 其實可以試試用primer架橋的方式
圖示如下:
BamH I EcoR I
G
GATCCctctgttcaac ggggacatgctctg ttcaacggggacatgG AATTC
CCTAG
Ggagacaagttgcccct gtacgagacaagtt gcccctgtacCTTAA G
如上圖所示 小寫部分是欲加入的小片段
可以分成六條primer 用BamH I和EcoR I處理過vector之後
將合成的primer加入一起做ligation
記得primer 5端要先磷酸化 也不可以用CIP處理
可以試試看 加油
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.123.86.42
1F：推 scherzoinb:這我還是第一次聽見耶...分生的知識不足...唉... 11/19 18:31
2F：推 scherzoinb:CIP是不是用在blunt end，sticky end不能用這個是嗎？ 11/19 18:33
3F：推 scherzoinb:謝謝你囉...感激... 11/19 18:36
4F：推 bluecsky:應該說blunt end比較需要CIP處理一下 11/19 20:07
5F：→ bluecsky:CIP是去掉5'的磷酸..避免兩個blunt end成self-ligation 11/19 20:07
6F：→ bluecsky:sticky end不是不能用..而是不需要.. 11/19 20:09
7F：→ bluecsky:因為兩個都是stick end的話是無法self-ligation的 11/19 20:09
8F：推 skylawer:樓上有一點點語病 是指兩端是不同 cutting site 比較精確 11/20 00:45
9F：推 bluecsky:哈..感謝樓上幫我補正 11/20 08:03