作者grandia (香蕉S大王)
看板Biotech
標題Re: [討論] in vitro kinase assay 與IP的差別 ??
時間Thu Nov 15 01:01:15 2007
※ 引述《natual (穿梭於藥品之中....)》之銘言：
: 敢請各位大大能否幫小弟我解答一個問題.最近看paper想不出的問題
: in vitro kinase assay 會作IP.但我的疑問是既然兩者都是用抗體去抓抗原的原理
: 那問什麼還要作transfection.多一道步驟
: 乾脆直接去找一個會與substrate作用的東西直接作IP去抓就好了..
: 這就是我的疑問 .....希望各位大大能給小弟一點指教
小小的提供一點意見
in vitro kinase assay 意指你要測量的protein是個kinase
需要透過IP的方式 把該kinase IP出來 然後在in vitro的方式 加入substrate
以及isotope P32 (或是其他label方式) 來測試這個kinase是不是有能力去將
substrate磷酸化
那target kinase 我看過有人會先overexpression 再用anti-tag ab去把protein作
IP 或者 也有人直接去用kinase specific ab 把 endogenous kinase IP出來 進行
後續的實驗 但是 經驗上 用tag ab去做IP的效果好很多 最起碼IP下來的protein量
真的比較多 第一因為protein經過overexpression 第二抗體效率比較高
相較於直接用specific ab去抓protein 第一 細胞內生性的protein量一定比
overexpression的來的少 第二抗體作IP的效率也沒有tag ab來的強
因此作endogenous protein要讓你IP出來 且要能進行接下來的kinase assay經過數次
wash等等 需要的protein量一定要夠多 不然也做不出來
所以 overexpression後 再做in vitro kinase assay是很常見到的方式 相對的也簡單
許多
不知道有沒回答你的問題...
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◆ From: 140.129.62.51
1F：推 blence:這個實驗通常有兩種目的,一個是看上游訊號對kinase活性變化 11/15 02:55
2F：→ blence:像cdk在不同cell cycle活性,是常以endo為主;至於探討kinase 11/15 02:56
3F：→ blence:活性與不同的mutant construct的差異就幾乎只有overexpress 11/15 02:59
4F：→ blence:可以選擇; 一般來說除非沒有可IP的抗體,不然用tag只是實驗 11/15 03:01
5F：→ blence:前置測試,最終還是要回到endo的實驗才比較被認同 11/15 03:06