vector: pETBlue己接上要表現的gene，約4.5Kb insertt: 做純化用的，his tag，約24bp control沒做...會記得要做 ligation: vector:insert=1:3 T4 ligase:16℃、16h (fermentas) total volumn: 10μl competent call: nova blue 有人跟我說︰試試看把ligation的溫度提高到20 or 22℃ 也有人說試試看用切enzyme去切5'端的phosphate 謝謝bluecsky大大給的意見...感激... 希望有經驗的大大...能多提供一些意見...謝謝... ※ 引述《bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)》之銘言： : 電穿孔要使用cuvet..用完還要洗..個人覺得很麻煩 : 而且competent cell製作比較麻煩(以時間觀點來看啦..外加我很懶..XD) : 基本上如果你要transform的大小不太大的話 : 能用heat-shock就用heat-shock : 你應該在每次做的時候都加入一組control : control是什麼?就是你沒切過的vector..直接拿1 ul做一組heat-shock : 理論上這一組應該可以長很多很多..如果沒長的話表示你操作有問題 : 要是長很少的話表示你這批competent cell效率太低 : 效率太低的話建議你重做一批..做cloning效率要是太差也很麻煩 : 另外..你做ligation的時候..insert:vector比例是多少..? : 還有你vector size跟insert size呢? : 此外..你ligation的條件跟時間呢? : ㄜ..其實我一般來說是根本不管他的size啦XD : 反正就直接拿很多的insert+很少的vector... : 每天下班前丟4度冰箱給他over-night.. : 第二天再來transform..或是把PCR設定成16度3小時 : 用PCR管子做ligation : 不過大多我都是選擇overnight..時間比較好控制XD : 第一次做會卡比較久啦..因為很多操作還不熟悉的關析 : 我第一次做一個成功的花了我三四個月吧.. : 然後就是無止境的做各種新的construct(實驗需要..(哭)) : 到目前為止已經可以達到兩週可以交出一個定序完整的construct了XD.. : 果然實驗都是做久就會熟練 : PS:可是每次做完後又會多出新的來做..囧 --

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