※ 引述《scherzoinb (scherzo in B Op. 20)》之銘言： : 目前transform一直長不出來 : 在做完double digestion後 : 做ligation，插入一段insert : transform 到competent cell裡 : 目前能確認的是︰ : 有做single digestion，確定enzyme都能切 : insert的切位是設計好的 : transform是用heat shock的方式 : 師說︰用電穿孔的效率比較高 : 還沒試過 : 找不到問題出在哪裡 : 做了快一個月 : 麻煩各位大大 : 幫忙一下 : 感激... : 第一次做clone的新手... 電穿孔要使用cuvet..用完還要洗..個人覺得很麻煩 而且competent cell製作比較麻煩(以時間觀點來看啦..外加我很懶..XD) 基本上如果你要transform的大小不太大的話 能用heat-shock就用heat-shock 你應該在每次做的時候都加入一組control control是什麼?就是你沒切過的vector..直接拿1 ul做一組heat-shock 理論上這一組應該可以長很多很多..如果沒長的話表示你操作有問題 要是長很少的話表示你這批competent cell效率太低 效率太低的話建議你重做一批..做cloning效率要是太差也很麻煩 另外..你做ligation的時候..insert:vector比例是多少..? 還有你vector size跟insert size呢? 此外..你ligation的條件跟時間呢? ㄜ..其實我一般來說是根本不管他的size啦XD 反正就直接拿很多的insert+很少的vector... 每天下班前丟4度冰箱給他over-night.. 第二天再來transform..或是把PCR設定成16度3小時 用PCR管子做ligation 不過大多我都是選擇overnight..時間比較好控制XD 第一次做會卡比較久啦..因為很多操作還不熟悉的關析 我第一次做一個成功的花了我三四個月吧.. 然後就是無止境的做各種新的construct(實驗需要..(哭)) 到目前為止已經可以達到兩週可以交出一個定序完整的construct了XD.. 果然實驗都是做久就會熟練 PS:可是每次做完後又會多出新的來做..囧 -- 上帝曾經說過 : 當一個人打你右臉的時候 你就要用日耳曼背橋摔壞它的左臉 --

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