作者cutebetty (Qb)
看板Biotech
標題[求救] 2D幾個問題
時間Mon Oct 29 21:46:24 2007
目前在進行2D時有一些問題發生
前幾次的實驗結果PAGE上的點都會有拖曳的情形發生
針對我實驗的過程我有幾個問題想請教板上的高手
1.如果要改善是否要調整IEF時Vhr的值?!
現在是用前人試過的條件來跑
我使用的是Bio-rad的 pH4-7 7cm strip
IEF條件為
50V rapid 30min
200V rapid 30min
1000V rapid 1hr
4000V linear 1hr
4000V rapid 33000Vhr (會不會太多)
200V rapid 維持
因為我翻參考資料 一般來說好像沒有設這麼多的電壓
我也不大清楚 rapid和linear的目的在哪?
2. 以7cm的strip來說 蛋白質的量最多可以加到200ug嗎?
3. 有些參考資料說增加DTT的量可以提高2D解析度 那是增加在rehydration的步驟
還是在equilibration的步驟?
4. 再者 一個很蠢的問題 做PAGE時要做上膠嗎? 我是都有做啦....
5. 跑12% PAGE時電壓我都用100V 可是Bio-rad建議是200V 哪一個較佳?
6. 最後 有哪些地方的改善是可以減少蛋白拖曳的情形? 除了加DNase外
希望大家可以提供我ㄧ些建議 感謝
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.129.77.129
1F：推 aggaci:2D....好恐怖的實驗..想到就頭皮發麻 10/29 21:47
2F：推 NKTcell:蛋白拖曳 是拖直的還是橫的勒? 橫的話就是sample沒處理好 10/29 22:26
3F：→ NKTcell:裡面鹽類太多 直的話就是第二維速度可能太快 10/29 22:27
4F：→ NKTcell:第2,3點 strip買來的時候說明說應該有寫吧 10/29 22:28
5F：→ NKTcell:我也有做上膠 可是上膠是Agarose 10/29 22:29
6F：推 dankai:推樓上! ^^ 我的電壓最高用到8000V~ 10/29 23:20
7F：推 cutebetty:我說的上膠是指一般PAGE的上膠,因為看說明書好像沒寫要 10/30 09:30
8F：→ cutebetty:樓上的電壓8000V是用7cm的嗎? 8000V好像太強了 10/30 09:31
9F：→ cutebetty:說明書上是寫7cm建議蛋白量最多為500ug 我是怕放太多解 10/30 09:31
10F：→ cutebetty:析度會不好,目前我是發現橫向拖曳的情形,所以是鹽太多囉 10/30 09:32
11F：推 dankai:^^ 我是做13cm~沒說清楚!抱歉~~~~ 鹽太多!多洗幾次sample~ 10/30 11:34
12F：推 Linton:1.單邊拖or雙邊拖? 4.都可以 5.有冷卻系統就200V,沒有就100 11/02 22:37