作者yumei (愛自己最重要)
看板Biotech
標題[求救] PCR,以前做的出來,現在做不出來了?
時間Wed Oct 24 16:43:45 2007
請教版上的PCR高手們,
我目前做的題目是關於細菌的基因,
我做的是陰性菌,目前在檢測細菌中是否帶有特定的基因,
這個實驗在今年二月做過一部份,結果良好,一切都沒問題,
因為之後收到更多的菌株,因此在九月時又重新進行此實驗
結果非常慘,再也跑不出來了!
連之前二月做的陽性菌株,現在也無法跑出我要的產物
原先懷疑是PCR的問題
所以目前試過3家dNTP,4家Taq,
調整過鎂離子濃渡由1.5mM試到2.5mM,結果連水都出現偽陽性
改變annealing的溫度下降2-4度
都無法再度amplify出正確產物,
後來又懷疑是否DNA有問題,
又重抽DNA兩三次
(使用過phenol/chloroform/Isoamyl Alcohol的方法也試了用kit抽DNA)
還是沒辦法Orz
目前還沒試的,只剩下加DMSO了
(等會就知道結果了T_T)
可是我二月時不加DMSO也可以跑出來呀~~~
有人可以再給我不同的建議嗎?
試了快兩個月了,再做不出來,我真的可以不用玩了Q_Q
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.96.207
1F：推 HIbaby:primer是新的還是舊的/ 要不要換另一組primer試試 10/24 17:01
2F：推 HIbaby:假陽性的產物 有定序過嗎? 二月的產物有定序看過序列嗎 10/24 17:02
3F：推 yumei:忘了說,primer有重新合成,新舊primer都試過 10/24 17:12
4F：推 yumei:二月產物有定序,是ok的,偽陽性無產物太弱,無法定序 10/24 17:15
5F：推 HIbaby:如果我是你 我會換不同位置的primer來試 10/24 17:25
6F：推 HIbaby:另外 做southern試試? , PCR水夠乾淨嗎? 用隔壁的PCR機器 10/24 17:26
7F：推 yumei:謝謝你的建議,我明天會試另一組primer--之前試了一次是失敗 10/24 17:43
8F：→ yumei:PCR水應該是ok的,我們家實驗室有好多台PCR機器,我應該都用了 10/24 17:44
9F：推 enisx:PCR buffer 壞了? 有這種問題我都reagent含水全部換掉 10/24 17:48
10F：→ enisx:很多因素會使得PCR發生問題而作不出來,先用作得出的人的東西 10/24 17:49
11F：→ enisx:再作一次看看吧! 當然如果你時間很多,一項項試誤找原因也可 10/24 17:50
12F：推 yumei:我試了四家Taq,buffer都有跟著換 10/24 17:50
13F：→ enisx:找作得出來的人協助看你問題出在那! 10/24 17:51
14F：推 snkre:dNTP有可能壞了,可拿別人可以work的dNTP試試 10/24 17:54
15F：推 yumei:加DMSO的結果出來了~失敗Orz...而且今天是別人幫我試的結果 10/24 18:37
16F：→ yumei:這組primer可能沒救了吧....Q_Q 10/24 18:40
17F：推 HIbaby:換primer比較快啦..換不同序列的 機會比較大 10/24 18:53
18F：推 peggie0903:dNTP的濃度是對的嗎？ 我剛進實驗室時一直拿十倍的～ 10/24 22:25
19F：→ peggie0903:做超久都做不出來 （好險老闆沒生氣） 10/24 22:25
20F：推 dankai:鎂離子濃度也不可過高...會影響dNTP作用~我實驗室學長就是 10/24 22:43
21F：→ dankai:多加了鎂離子..作了很久都做不出來!最後降低鎂離子就出來了 10/24 22:45