作者lentivirus ()
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標題Re: [方法] 如何對plasmid做site-directed mutation ?
時間Sat Oct 20 21:42:58 2007
其實做site direct mutagenesis方法還蠻多種的，
這個方法還不錯用
1 3
(RE1)----> ---->
RE1------------------X------------------RE2
<---- <----(RE2)
2 4
A: (RE1------------------X---)
B: (---X-------------------RE2)
C: (RE1------------------X-------------------RE2)
1st PCR: 分別做 primer 1 及 primer 2, primer 3 及 primer 4
得product A 及 product B (template source: target plasmid)
要將product cut and purify
2st PCR: 分別做 primer 1 及 primer 4
得 product A、B、C (template source: product of 1st PCR (1:1)
取product C--->purify, cut by RE1 and RE2
將target plasmid for SDR, cut RE1 and RE2 (取長段，短段為置換)
Ligation---transformation--->colony identification by sequencing
Note：RE1-------RE2的長度當然愈短愈好，一般大概三到五百bp
RE1及RE2最好是unique site (避免cut vector)
primer 2,3 design部分最好要變的點在中間，前後各延長10~15bp
GC結尾，specificity較高
以上我常用的方法，另外還可以用PCR的方法跑一整圈plasmid，
然後用Dpn1 cut 再接，實驗室有人做，應該是ok
有需要再提供給大家好了...我也沒實際試過 ^^""
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◆ From: 61.217.31.60
1F：推 rickson:有錢的話直接去買mutagenesis kit，然後primer不需要純化 10/20 22:01
2F：→ rickson:多挑幾個就好了 10/20 22:02
3F：推 blence:何必買kit,以一般不易突變的pfu做PCR的reagent拿來用就ok了 10/20 22:18
4F：推 liuse:我也都是用樓上說的 pfu 做完記得定全長確定其他沒錯 10/20 23:39
5F：推 aggaci:好麻煩 直接quick change不就好了 10/22 03:16
6F：推 HUVEC:我也是用quick change，不過貴一些就是了 10/23 14:27