※ 引述《kayle (kay)》之銘言： : 關於mammalian cell total protein extraction的問題 : 因為lab設備問題,無法用物理方式破細胞 : 我在網路上找了幾個buffer : 目前用的是類似RIPA的配方 : 含Tris, NaCl,EDTA, 0.2% Triton, 0.1% SDS, 1mM PMSF : 10的6次方細胞加入50ul : 再把細胞lysis後,12000rpm,離心 30 min之後 : 有個取上清液的步驟 : 我可以很清楚的看到細胞被lysis, solution成透明 : 可是整個solution呈現很黏稠的的情況(DNA造成的嗎?) : 幾乎沒辦法取"上清" 這個配方的lyse算是很暴力的 破膜破核，許多membrane-associated protein都會release出來 我有做過類似的實驗，為了extract頑強的membrane-associated protein 黏稠後100度去煮個十分鐘(小心不要讓水蒸乾) 溶液會不黏稠 之後dilute total solution volumn讓solution中SDS濃度降低 這樣之後sample可以IP，或做其他的用途 我這樣做是OK 但是一般用buffer破細胞應該不需要加SDS吧 我自己的實驗經驗一般用NaCl配上Tx-100和其他八拉八拉的inhibitor 就很好用了 : 除了增加reagent用量外 : 該怎麼處理這個情況?? : 請有經驗的大大幫忙一下,感謝!! : 另外一個笨問題 : SDS是很強的介面活性劑吧 : 那他到底會不會把protein denature掉?? 會喔，整個把native protein翻出來 : 那如果後續要做蛋白質純化 (protein要有function) : 是不是就不應該用SDS?? 的確不能 : 那又該用什麼reagent來lysis細胞呢??? 就用一般的吧 我的lyse buffer(whole cell extract buffer)是 NaCl 150mM or 200mM Tx-100 0.2% Tris-HCl(pH 7.5) 20mM EDTA&EGTA 1mM 和protease inhibitor，DTT，若是要研究phosphorylation還 要加phosphatase inhibitor : 感謝!!! 希望對你有幫助 -- --

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