作者wanyi (我討厭吃便當!!!!)
看板Biotech
標題[問題] NotI digestion的問題
時間Tue Mar 6 04:21:44 2007
最近在做cloning
好不容易把100bp的insert弄進plasmid之後
現在又遇上了NotI不切的問題
我要做的是一個double digestion (BsrGI/NotI)
因為兩者buffer不一樣~所以先切BsrGI
Qiagen kit purify之後再切NotI
之前有試過似乎要overnight才會切的比較好
但效果還是很差
我查過NEB的catalog說NotI是methylase sensitive
但是實驗室沒有Dam-/Dcm-的strain
想問大家有沒有人在這樣的情況下有比較好的方法
還是digestion overnight是唯一的方法呢?
對了，我現在用的是DH5 alpha competent cell
謝謝!!拜託高手幫忙~
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夜已晚的很美麗 天已亮的很分明
我在你的回憶裡 是黃昏還是黎明
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◆ From: 140.180.7.220
1F：→ wanyi:對了補充一下 RE也是NEB的 03/06 04:22
2F：推 blence:NotI是CpG island sensitive,你上面的想法不是切不好的理由 03/06 06:36
3F：推 wanyi:謝謝你~我應該是誤會了! 那請問有什麼方法可以解決嗎? 03/06 14:06
4F：推 zytase:NotI,含切位:24個base->90% cleavage @ 37度 20小時 03/06 15:56
5F：→ zytase: 20個base以下->0~10% @ (同上條件) 03/06 16:02
6F：→ zytase:以上是針對 DNA fragments,基本上它是需要over night~ 03/06 16:04
7F：推 wanyi:謝謝你!!!那我還是努力的延長反應時間吧! 03/06 23:41
8F：推 oooya:請問有幾個切點???切太久也不太好 主要還是要看你的用途為何 03/07 00:46
9F：推 wanyi:我的plasmid上只有一個NotI site,試過三個小時切不好 03/07 01:20
10F：推 oooya:請問已經做好的clone 要再把他切開來的目的為何? 03/07 17:54
11F：推 wanyi:要把一段gene用另一個PCR產物取代~ 03/08 01:54
12F：→ wanyi:所以我vector跟PCR product都要用NotI切 03/08 01:56
13F：推 shaline:會不會沒加BSA啊?! 03/10 01:34