作者rita1986 (朝目標邁進)
看板Biotech
標題[問題] GST-Fusion Protein的純化
時間Fri Mar 2 19:57:03 2007
用IPTG induction完 加triton sonication後離心的上清液
跑SDS-PAGE可明顯看到我要的 protein band
但用 glutathion sepharose 純化完 protein 濃度很低
以下是我的 protocol
將 glutathion sepharose 4B 4c.c. 裝入column
wash 2X wish cold PBS
wash 1X wish cold PBST
加 protein 上清液 (bind 2 hrs shack 4度C)
wash 2X wish cold PBST
wash 1X wish cold PBS
elute wish 20mM glutathion reduced
請達人們幫我看看哪裡出問題
向各位求教了
謝謝
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.15.163.64
1F：推 hkaiwei:有沒有PAGE可以看一下? 03/02 23:36
2F：推 deathscytheX:你elute buffer是在PBS還是Tris?? 03/02 23:57
3F：推 bee:還有一個可能是蛋白沒吸上 03/03 00:24
4F：推 rita1986:回2樓的~~是PBS裡 沒抓到蛋白 到底哪出問題??? 03/03 01:27
5F：推 NKTcell:問題應該在lysis buffer的成分 另一方面 如果運氣夠差的話 03/03 01:38
6F：→ NKTcell:有的蛋白就是抓不下來 即使有被induce出來 這是很弔詭的 03/03 01:39
7F：推 Bluecold:GSH-shepharose是怎麼equibriment的? 如果只用2Xbuffer 03/03 04:06
8F：→ Bluecold:可能不太夠 建議用10x或是20X左右equibriment 03/03 04:07
9F：推 rita1986:X是我洗的次數 2X就是說6ml PBS洗兩次 03/03 12:02
10F：→ rita1986:樓上的前輩是說要洗個10到20次體積的PBS 03/03 12:05
11F：推 cyken:可能是lysis buf的問題,把flow thru和wash出來的都拿去跑膠 03/03 12:10
12F：推 turtledodoha:如果你的protein沒有要在進一步的purify或與其他 03/03 22:11
13F：→ turtledodoha:protein interaction，你可以直接加適量的SDS sample 03/03 22:12
14F：→ turtledodoha:buffer去煮，跑SDS-PAGE來check 03/03 22:13
15F：→ turtledodoha:是否有在2h內binding成功，wash後的上清液也可以確認 03/03 22:14
16F：推 deathscytheX:沒抓到蛋白?所以拿Sepharose去loading也沒有protein? 03/04 01:45
17F：推 rita1986:謝謝各位的解答 ^^~ 絕定先把triton改lysozyme破菌試試看 03/04 13:04