※ 引述《Adler (Adler)》之銘言： : ※ 引述《cayumi (far away)》之銘言： : : 所使用的enzyme是哪家公司的!? 又是哪一種enzyme!? : : digestion的方式是single digestion還是double digestion!? : : plasmid是用kit抽的還是用傳統的抽法!? : : gel是用幾%的!? elution kit是用哪家的!?(有的廠牌回收率不好) : : 51bp應該會在100bp之下吧 有辦法的話附個電泳圖會比較好 : : ligase是用哪家的!? ligation的溫度和時間是!? : : 你是transformation之後沒長菌 還是長出來都是self-ligation!? : : 資訊多一點會比較好判斷哪裡出問題 : : 我的經驗是insert越小的越好接 : : 做cloning有時很運氣 有時隨便接隨便有 有時做到掛點都沒用 : enzyme與ligase是用Promega的 Promega的enzyme我沒用過 我只用過TAKARA 和Bio-lab(NEB)的enzyme Promega的的T4 ligase 他本身附的是10X buffer 他們公司另外有出一種 2X rapid ligation buffer,我是都用這個 ligation buffer 我ligation的方法是 insert: 8μl vector : 3μl 2X buffer:12μl ligase: 1μl 置於16度c水浴槽(or 4度C)作用至少16個小時以上 以heat-shock的方法做transformation : elution kit是用Viogen的 我們家是用GeneMark的elution kit 個人認為滿好用的 : plasmid也是用Viogen的midi kit抽 我plasmid都是用一般傳統的mini-preparation抽的 : run plasmid 的gel為1% ; run insert的gel為2% 可以踹看看用3%的gel(注意3%很容易就凝固了) 跑100V 40分鐘 : plasmid為single digestion 所以你vector有做CIP處理嚕!? CIP處理時間太久會影響到你ligation喔 : ligation的時間為4度 overnight : transformation後沒長菌 抗生素沒用錯吧 有看過很天兵的朋友用錯抗生素 == ==+ : 另外,insrt的band分布於100bp 其下亦有(連續的) 這個我覺得有點怪怪的 應該只會出現single band吧,不應該有連續的band吧 可是照理說用Kit抽應該不會有RNA的干擾才對,可以放張電泳圖嗎!? 還有elution完後有load 1μl(怕太淡可以load 5μl)下去跑電泳check嗎!? : 故才可確定內含insrt : 謝謝~^^ 不久前我們lab的學妹要把100bp左右的片段接到7 kb的vecor上 我是敎她insert和vector都分別用NEB的enzyme做double digestion 用100V跑3%gel 40分鐘,elution ligation的條件就如上述所說的 做個兩次就出來了 你在踹看看吧 另外問一下,你用的切位是TA-vector本身的切位,還是你自己在primer上設計的切位!? -- 心一但開始動了，與沉靜便劃不上等號........ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.52.141