※ 引述《cayumi (far away)》之銘言： : ※ 引述《Adler (Adler)》之銘言： : : 不好意思,之前寫得淺了 : : 我的insert只有51b.p. 要接在5kb的vector : : vector為pET23a 已接有另一段約1.4kb的基因 : : insert已經接到另一TA vector上 為pTZ57R/T : : 目前是用RE切出insert 由於plasmid的濃度高 : 所使用的enzyme是哪家公司的!? 又是哪一種enzyme!? : digestion的方式是single digestion還是double digestion!? : plasmid是用kit抽的還是用傳統的抽法!? : : 所以在gel extraction前 可確定在約100b.p.附近有一粗亮的band : gel是用幾%的!? elution kit是用哪家的!?(有的廠牌回收率不好) : 51bp應該會在100bp之下吧 有辦法的話附個電泳圖會比較好 : : competent cell也已確定無問題 : ligase是用哪家的!? ligation的溫度和時間是!? : 你是transformation之後沒長菌 還是長出來都是self-ligation!? : 資訊多一點會比較好判斷哪裡出問題 : 我的經驗是insert越小的越好接 : 做cloning有時很運氣 有時隨便接隨便有 有時做到掛點都沒用 enzyme與ligase是用Promega的 elution kit是用Viogen的 plasmid也是用Viogen的midi kit抽 run plasmid 的gel為1% ; run insert的gel為2% plasmid為single digestion ligation的時間為4度 overnight transformation後沒長菌 另外,insrt的band分布於100bp 其下亦有(連續的) 故才可確定內含insrt 謝謝~^^ --

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