※ 引述《yffurdyeknom (Unhurried Justice)》之銘言： : 如題 : 請問板上有做過帶有6 his-tag fusion protein純化的大大 : 在從column上elute蛋白的時候 : 是用多少imidazole濃度的elute buffer去elute的? : 小弟用175 mM imidazole的elute buffer去elute : 但似乎沒有elute出來 : 而查純化的書 : 上面寫在某些case中 : 要用250 mMimidazole濃度的elute buffer去elute : 因此想問問大家是否有用如此高濃度imidazole濃度的elute buffer去elute的經驗 175mM 如果洗不出來 有幾種可能 第一個他的結合力太強......這種可能性不大但不是沒有 His-tag 有一個特色其實妳用到100 mM imidazole 就會開始有些蛋白開始洗出ꠊ只是量很少 第二個 我曾經用到　500　mM imidazole 沒有問題 第三 妳的蛋白根本沒有結合到管柱上面去 可能是過柱的條件不對或是妳的蛋白根本就沒出來 過柱的時候把每一個fraction 都收一點 一起跑膠確認妳要的東西跑到哪裡去 : 如上述所題 : 小弟這次的純化沒有成功 : 因此也考慮fusion protein存在於inclusion body中的可能性 : 在lysate(BL 21)離心(11000rpm 30min 4度c)之後 : 觀察到存於離心管管壁上的pellet非常難用水洗掉 : 加普通的detergent也洗了半天才洗掉 : 而以之前純化E.coli(DH 5 alpha) plasmid的經驗(同樣都是100ml culture) : 在lysate離心(11000rpm 30min 4度c)之後管壁上的pellet不會難洗 : 因此在此才推論fusion protein存於inclusion body中的可能性 : p.s. 在此之前我有先進行一次1ml culture的test實驗 : 結果我要的fusion protein的確是存在於supernatant之中 : 在此也順便請問一下板上高手們 : 什麼情況下會形成inclusion body? : 我在一本純化的書中看到culture size會影響 : 所以我推測這是fusion prtein從原本test顯示的supernatant中跑到inclusion body原因 : 不知這樣是否正確? 這是一種可能 其實這一點很容易確定 每次做大量培養誘導蛋白產生時 除了大瓶收下來以外 妳也可以同時收個小量 先做確認 當然會多花一點時間跟功夫 但是至少不會做到後來甚麼蛋都沒有 就算失敗也至少可以知道問題出在哪裡 : 而我也想請問大家這樣會形成inclusion body的原理是什麼? : 還有也請問大家 這太複雜 自己看一下書 : 離菌或離lysate時的溫度會有造成inclusion body形成嗎(我都用4度c)? 沒聽說過 也不太可能 inclusion body 主要是培養條件造成的 做成lysate 　時菌體已經打破 他想形成恐怕還沒機會 : 又如果把經IPTG induce之後的菌液冰到4度c三個小時後再處理(lyse) : 也會造成inclusion body形成嗎?: 問了一堆問題 同樣的答案 如上 主要是因為培養條件 冷凍會讓細菌的生長減到很慢 : 希望有經驗的前輩們給我一些指示~~~ : 謝謝 --

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