如題 請問板上有做過帶有6 his-tag fusion protein純化的大大 在從column上elute蛋白的時候 是用多少imidazole濃度的elute buffer去elute的? 小弟用175 mM imidazole的elute buffer去elute 但似乎沒有elute出來 而查純化的書 上面寫在某些case中 要用250 mMimidazole濃度的elute buffer去elute 因此想問問大家是否有用如此高濃度imidazole濃度的elute buffer去elute的經驗 如上述所題 小弟這次的純化沒有成功 因此也考慮fusion protein存在於inclusion body中的可能性 在lysate(BL 21)離心(11000rpm 30min 4度c)之後 觀察到存於離心管管壁上的pellet非常難用水洗掉 加普通的detergent也洗了半天才洗掉 而以之前純化E.coli(DH 5 alpha) plasmid的經驗(同樣都是100ml culture) 在lysate離心(11000rpm 30min 4度c)之後管壁上的pellet不會難洗 因此在此才推論fusion protein存於inclusion body中的可能性 p.s. 在此之前我有先進行一次1ml culture的test實驗 結果我要的fusion protein的確是存在於supernatant之中 在此也順便請問一下板上高手們 什麼情況下會形成inclusion body? 我在一本純化的書中看到culture size會影響 所以我推測這是fusion prtein從原本test顯示的supernatant中跑到inclusion body原因 不知這樣是否正確? 而我也想請問大家這樣會形成inclusion body的原理是什麼? 還有也請問大家 離菌或離lysate時的溫度會有造成inclusion body形成嗎(我都用4度c)? 又如果把經IPTG induce之後的菌液冰到4度c三個小時後再處理(lyse) 也會造成inclusion body形成嗎? 問了一堆問題 希望有經驗的前輩們給我一些指示~~~ 謝謝 --

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