※ 引述《baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)》之銘言： : 想請問大家CLONING~~~拜託拜託~~~ : 做好幾個月了~~還是弄不出來~~ : 我的insert約1.8kb~~在PRIMER上設計BamHI 與 SmaI切位 : 後來實在沒辦法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC) : 我使用的VECTOR有6.8kb : 後來做SUBCLONE還是接不進去~~ : GEL EXTRACTION的KIT是用慧眾的~~ : 看圖是都有切但是就是接不進去 : 有可能是酵素亂切嗎?!BUF壞掉嗎~~???!!!! : 嗚嗚~~~求救~~~ : _ 由於你給的資訊很少, 因此就你所給我們的資訊, 我們也很難正確的幫你判斷你真正的問題出在哪裡..... 頂多只能告訴你該做什麼control, 該留意什麼事情.... 如果可以的話, 不知你是否願意寫的詳細一點.... 包括 TA-vector是用哪一家牌子?叫是什麼名稱? vector是用哪一家牌子?叫是什麼名稱? (這樣方便我上網找出map, 進而判斷在vector上的cut site是否選取恰當,有問題) 最好是能把實驗流程寫一下..... RE怎樣作用?在什麼溫度?用什麼buffer? 怎樣純化DNA?用什麼方法?什麼KIT? 您寫的越詳細, 我們才能精確的幫您判斷可能發生問題的因素..... 言歸正傳......根據你所給的資訊....而加以推論..... 你的insert最出是用PCR的方式做出...並且primer上加上BamHI and SamI.... -->做不出來!! (可能是由於primer上5'端沒有額外加base所造成) 之後, 你將insert接在TA-vector上.... 並且先用SmaI再用BamHI切..... -->仍然做不出來!! (因為insert已經接在TA-vector上..就和primer上5'端有無額外加base已經無關... 推翻先前假設.....) 先用SmaI切, 假設你是用NEB的RE.... SmaI是用NEB buffer4..... 就算你沒有換buffer直接加入BamHI作用.... BamHI在buffer4的作用活性也有75%..... 因此RE在insert上的作用應該很好........ 接著看vector的作用能力..... 你說你的transformant colonies長的很多, 但很可惜沒有做vector的control.... 由於你的colony長很多...但卻沒有一各是你要的clone.... 因此就可以直接看成是vector的control.... (雖然不知道挑出來的是vector only還是雜菌.....) 也就是說.....你的vector作用不好...... 你的問題....應該是出在RE作用在vector這各地方..... 至於原因為何? 由於您給的資料很少....所以無法判斷..... 以上小弟推論.....不知有無幫上忙.... --

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