作者Shamino (萬年豬)
看板Biotech
標題[問題] 請問抽取yeast plasmid
時間Wed Feb 14 22:42:11 2007
最近在做抽yeast plasmid,再transformation 至 E.coli
不過抽取yeast plasmid 總是抽的很不穩定,
transform 至E.coli的 plate colony幾乎不會長或是極少( n < 5 )
因為市售的kit很貴
試了molecular cloning中的方法覺得很難用之後
從網路上找到了兩種prtotocol
http://www1.qiagen.com/literature/protocols/pdf/PR04.pdf
跟
http://www.med.unc.edu/~hdohlman/plasmidisolation.html
這兩種都是用 mini-prep 的方法 再加入 beads 來抽取yeast的 plasmid
不過這兩種方法還是很不穩定, 失敗率還是很高
目前是已經先行排除後續trasformation的問題(非 competent cell, plate 等)
也並非yeast cell來源的問題( 同一株yeast 接出來抽,時好時壞)
而小弟的方法流程就跟上面的protocol一模一樣,兩種都試過,都時好時壞
想請問有先進是用類似方法做的很穩定又好的嗎?
希望有任何可以指點小弟的地方
感謝再先呀
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.139.222.8
1F：推 kirry:抽yeast plasmid,再transformation 至 E.coli ??這是? 02/14 23:32
2F：推 freesoul:是yeast 2 hybrid後續要拿candidate出來嗎? 02/15 02:40
3F：推 cplinn:有什麼奇怪 amplification 用啊 02/15 02:40
4F：→ freesoul:假如是這樣的話我的經驗是PCR送sequence後問有沒有人有 02/15 02:41
5F：→ freesoul:還比較快...XD 02/15 02:42
6F：推 angelhunter:我的經驗是要用電菌的 效率差很多 可能是plasmid太髒 02/15 09:25
7F：推 ROKEE:我猜原po可能為了要定序吧 02/15 12:20
8F：→ ROKEE:如果真的如我假設,那乾脆加熱破yeast後直接拿crude extract 02/15 12:20
9F：→ ROKEE:做heat shock送E. coli就好，還是會長...... 02/15 12:21
10F：→ ad1980:我前輩試過，據他的經驗用heat shock transform 出來真的很 02/15 12:29
11F：→ ad1980:很少，建議用electroporation，efficiency好很多，真的。 02/15 12:30
12F：→ ad1980:我做Y2H的時候也是要抽，但我是用electroporation， 02/15 12:32
13F：→ ad1980:完全沒有這個問題...所以可以試試看。 02/15 12:33
14F：推 tin0101:去買genemarl plasmid kit 很便宜. 02/15 13:06
15F：推 ROKEE:crude extract沒辦法用電的,一定會爆給你看XDD 太髒了... 02/15 13:12
16F：→ ROKEE:我連ligation product都會爆炸 @_@ 非得先純化才行 02/15 13:13
17F：→ ROKEE:而且heat shock送E. coli效率綽綽有餘,又比用電的方便很多 02/15 13:13
18F：推 Shamino:感謝各位提供不少意見:)這幾天小弟會再試試:) 02/15 14:51