作者baca (大笨蛋大笨蛋~~~~~)
看板Biotech
標題[求救] cloning~~~cloning~~
時間Wed Feb 14 22:18:54 2007
想請問大家CLONING~~~拜託拜託~~~
做好幾個月了~~還是弄不出來~~
我的insert約1.8kb~~在PRIMER上設計BamHI 與 SmaI切位
後來實在沒辦法就先接在TA-VECTOR上(牌子是RBC)
我使用的VECTOR有6.8kb
後來做SUBCLONE還是接不進去~~
GEL EXTRACTION的KIT是用慧眾的~~
看圖是都有切但是就是接不進去
有可能是酵素亂切嗎?!BUF壞掉嗎~~???!!!!
嗚嗚~~~求救~~~
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.60.28
1F：推 Ackbar:TA 接進去了? 02/14 22:29
2F：推 baca:嗯嗯對阿~~我在PCR產物後加A~~用TA的KIT接近去了~~ 02/14 22:35
3F：推 Ackbar:那你確定你subclone用的vector接點跟你的insert兩端互補嗎 02/14 22:40
4F：推 baca:我用vector切位也是BAMHI跟SMAI兩沏位鄰近 02/14 22:42
5F：推 kirry:蝴蝶牌的Sma I的限制酵素切割的溫度為25度喔 這點有注意到嗎 02/14 23:13
6F：推 baca:有～～水浴25切 02/14 23:33
7F：推 kirry:你接在TA vector上 可個別切一刀 試試看是否是buffer或是限 02/14 23:37
8F：→ kirry:製酵素的問題..還有你的DNA濃度呢 02/14 23:39
9F：推 baca:切一刀都沒問題～～我用2500ng去切insert 02/14 23:42
10F：→ kirry:切完後 純化的濃度呢 02/14 23:46
11F：推 baca:在ＴＡ上ㄉＩＮＳＥＲＴ切下來2刀下來後剩385ng 02/14 23:50
12F：推 cplinn:你所謂接不進去是什麼樣的狀況? control 和 ligation 的 02/15 02:31
13F：→ cplinn:transformant 一樣多? 還是比較多但找不到正確的 clone? 02/15 02:31
14F：→ core308:你的vector夠純嗎 將其純化再用限制酵素作用看看 02/15 09:15
15F：→ core308:另外可以的話兩刀分開切(vector) 02/15 09:16
16F：推 baca:我的transformants滿多的~~淡沒有做VECTOR ONLY的CON~~~ 02/15 09:52
17F：→ baca:我是先沏SMAI再沏BAMHI~~~ 02/15 10:09
18F：推 cplinn:vector only 是絕對必要的 可能你得到的都是 self-ligate 02/15 13:32
19F：→ cplinn:看來還是 vector 處理的問題 下次接時用「少很多」vector 02/15 13:34
20F：→ cplinn:再接接看 還有記得補上 vector only 02/15 13:35