作者ad1980 (Apoptosis)
看板Biotech
標題[問題] Lipofectamine 2000
時間Tue Feb 13 15:59:09 2007
我查了了，我transfect的時候照說明說書上的，
cell confluency ~ 90-95%
6-well tray: DNA 3ug, Lipofectamine 4ul,
用的medium 是 Opti-MEM，
隔天看，細胞是沒有死很多，可是因為我是用GFP-tagged的，
在顯微鏡下，可以看到只有大概20%有GFP signal...
我只有incubate 24 hrs at 37C，
不過expression 應該24小時就夠了吧？！
試了幾次，最好的也只有50% efficiency...
有用過的版友都是一用就達到說明書上的
80-90% transfection efficiency 嘛？
所以想請教一下，是我忘了注意什麼重要的細節嘛？
順便想請問一下，如果DNA放太多，會不會造成細胞怪怪的阿？
因為我看有GFP signal 的細胞，nucleus 都是 weird shape，
正常的細胞核都沒有GFP signal...@@..
這讓我很confused,
不知道那些有GFP signal 的細胞是真的有成功transfected的嗎？
先謝謝了。
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夢想和現實是有距離的。
一切都將重新開始....
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 64.180.57.97
1F：推 ivyshuang:看你是什麼cell,不同Cell line的effeciency會差很多喔~ 02/13 16:06
2F：推 zafirlukast:慢慢練囉...我也是一直進步.但是還是沒到說明書上的值 02/14 01:16
3F：推 bee:DNA 對 Lipo 的 ratio 很重要....我們平常用的比例 1:4 02/14 01:33
4F：→ bee:妳可以考慮看看這個比例......有進去的話24小時足夠看到你要的 02/14 01:34
5F：推 Euronymous:1:4?請問一下你們計量DNA的單位是什麼? 02/14 22:52
6F：推 lytic:如果你欲表現的產物較大.使可以考慮延長表現的時間. 02/14 23:01
7F：推 bee:1 ug DNA 對 4 ul lipo 最多一個well 不超過 2 ug DNA 02/15 04:24
8F：推 ad1980:我是用HeLa和vero，感覺HeLa的efficiency比較好。 02/15 12:21
9F：→ ad1980:我最近是的比例是3:4，看起來，我好像用太多了？ 02/15 12:23
10F：→ ad1980:DNA太多反而效果會不好嘛？ 02/15 12:26
11F：推 ad1980:很感謝大家的熱心回答，我再試試看。 02/15 12:28
12F：推 Duckhunter:80-90%~原廠說明書看看就好~有PAPER證明較重要 02/15 23:34
13F：推 bee:DNA 太多當然不好....效率不升反降喔...但是這個東西有時候不ꐠ 02/16 02:20
14F：→ bee:一樣的plasmid 跟不同的細胞條件不會一樣 02/16 02:20
15F：→ bee:Hela 1:4 肯定夠了 02/16 02:21
16F：推 Vienne:我用過293T cell line,效果還不錯 DNA的確不能加太多 03/30 14:29