作者allisa (小晴)
看板Biotech
標題Re: [問題] 關於一個protein alpha-synuclein
時間Thu Feb 8 00:09:25 2007
※ 引述《allisa (小晴)》之銘言：
: 這個蛋白我做western一直都壓不出來
: 看賣抗體的網頁 也沒有他試做的片子
: 想問問 有沒有人壓出來過?
: 是不是特別難壓?
: 還是他表現量原本就很少?我的protein需要濃一點阿?
: 謝謝
我的步驟
我其他的蛋白都壓得很正常 只有這個蛋白一直壓不出來
跑膠的時候 上膠12% 下膠6%(這有點忘了) 不過都跟實驗室其他人是一樣的
110V 120min 之後transfer用400mA 65min
blocking的牛奶用1.25g泡25ml(一片膠的用量) 室溫搖一小時
一抗我是用1:1000(用PBS稀釋) 4度C overnight
之後用1X PBST洗5min*3
二抗是用0.5g泡10ml的牛奶加4ul抗體(抗體原液先用甘油1:1稀釋抗凍過)
搖一個小時 室溫下 之後用1X PBST洗5min*3 + 10min*3
接著使用ECL壓片
大致上的步驟是這樣 謝謝
然後說明一下壓不出來的情形
是整張membrane壓出來都很空白
只有在分子量很大的地方 大約50~60有一條明顯的band
但是我要壓的synuclein應該只有14左右
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.145.91
1F：推 NKTcell:可以押出東西 那過程應該沒問題吧 可能你的sample原本就 02/08 03:58
2F：→ NKTcell:沒alpha-synuclein 要不然就是抗體的問題了 02/08 03:59
3F：推 alaric:可以考慮transfer時間加長.. 02/08 19:03
4F：推 allisa:為什麼會建議transfer時間加長呢? 那電流要改嗎? 謝謝 02/08 22:33