小弟我現在在幫老闆做cloning 流程是這樣的: 先將一段老闆設計的約100bp的小片段insert接進vector A中 再transform到細菌中放大 將plasmid抽出 把insert切下來 再將insert接進vector B中 (protein expression vector) 然後將protein表現出來 現在遇到的困難是在抽plasmid的這一步一直無法突破 我用TB養菌 (6ml,280rpm 24hr 或 1ml LB 3hr再倒到50ml TB, 20hr) 用傳統方法做plasmid maxi-prep 做了許多次 抽出的DNA量都不多 若是以回溶在200ul TE中來看 以OD260估計濃度最多約200ng/ul (也就是說稀釋200倍去測OD260不到0.1 根本不準) 但是不管如何260/280 ratio 總是保持在1.8~1.9之間 若是以”跑電泳和marker比較亮度”來估計濃度的話則會更少 不到100ng/ul Lab中其他人使用同樣方法的經驗都可以抽到總量100~200mg的DNA 對於我抽maxi的量跟抽mini差不多都十分驚訝 我不知道在操作上到底有何問題 學姐也有全程監控過 並且也曾和我一起做過 學姐抽出來的量有比我多一點點 但還是很少 她也不知道問題在哪 我有想過: 1. 下次養菌的時候將抗生素Ampicillin由50ug/ul提高到200ug/ul 以增加plasmid數 2. 其實我手邊insert有兩段 兩段序列不同但流程一樣 每次抽maxi的結果其中一種的DNA量總是會比另一種多個2~3倍 自從我發現這個現象後就覺得養菌的結果好像也是一瓶比另一瓶稍濃一些 (不曉得是不是心理作用) 我想這會不會是接進了insert的plasmid對細菌有toxic effect之類的 或是不曉得什麼原因使copy number降低 而其中一種insert的影響比另一種來得明顯? 我之所以會懷疑是insert造成的影響是因為Lab中的其他學長姐也做過 同樣的實驗流程 用同樣的vector 只有insert和我不同 對於我的猜測不知道版上各位強者大大有沒有什麼建議及批評?? 麻煩各位了!! m(_ _)m --

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